【技术实现步骤摘要】
水稻抽穗期调控基因Hd6的靶向敲除方法及其突变体和应用
[0001]本专利技术涉及属于水稻基因工程及作物遗传育种领域，涉及水稻抽穗期调控基因编辑，具 体涉及一种水稻抽穗期调控基因Hd6的靶向敲除方法及其突变体和应用。
技术介绍
[0002]抽穗期作为水稻重要的农艺性状，由自身遗传因素和环境因素共同决定，对品种生态适 应区域和产量因子均有较大影响。水稻抽穗期调控机制一直是分子生物学家和育种家关注和 研究的热点。研究水稻光周期调控开花的分子机理，对揭示水稻区域适应性、扩大种植范围 具有重要的指导意义。
[0003]传统育种调控水稻抽穗期，主要是通过杂交、回交、复交、阶梯杂交等将目标基因导入到背 景亲本中。其主要的缺点是耗时长，需要多代的杂交、回交或者自交才能获得稳定遗传的早 熟水稻新品种。近年来发展起来的基因编辑技术是研究植物基因功能和农作物品种改良强有 力的手段之一，利用基因编辑技术育种具有精准、高效、省时、省力和安全等特点。其中 CRISPR/Cas9基因组编辑技术已被用于创造定向的敲除、敲入来沉默或微调靶基因的表达， 可以通过对植物自身基因的快速、定点改变，实现对作物性状的精准改良。
[0004]水稻光周期是一个巨大而复杂的分子调控网络。这复杂的基因调控网络大致可以分为两 个开花途径，OsGI
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Hd1
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Hd3a/RFT1和Ghd7
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Ehd1
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Hd3a/RFT1，其中OsGI
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Hd1
‑>Hd3a/RFT1为 水稻和拟南芥共有保守途径，Ghd7
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Ehd1
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Hd3a/RFT1途径为水稻特有途径。已有相关报道对 开花途径通路上的相关基因进行编辑，这些基因包括Hd1,Ghd7,Ehd1,OsGI,Hd2,Hd4等，但这 些研究的成果是将水稻的抽穗期提前近一个月，从育种利用角度，这对小范围内跨区域水稻 品种改良并没有实际的应用价值。
[0005]Hd6基因是在粳稻和籼稻杂交的回交后代中检测到的一个涉及水稻光周期敏感性的数量 性状位点基因。通过图位克隆和遗传互补分析获知，Hd6基因编码酪蛋白激酶CK2的α亚基。 日本晴和Kasalath在编码区域存在一个核苷酸的替换，即由Kasalath中编码第91位赖氨酸的 AAG突变为日本晴中的终止密码子TAG，造成蛋白翻译提前终止，导致日本晴中CK2α功 能丧失，而来自Kasalath的Hd6等位基因在长日照和自然生长条件下抑制开花，是Hd1基因 的促进因子，其对Hd1间接的翻译后修饰，而在短日照条件下则不能延迟水稻抽穗。目前， 尚未有报道通过CRISPR/Cas9基因编辑系统针对水稻的Hd6基因进行定点突变，创制不同抽 穗期水稻株系，特别是适用于长江中下游不同生态区的早熟水稻品种。
技术实现思路
[0006]针对上述存在的问题及为了达到上述目的，本专利技术提供水稻抽穗期调控基因Hd6的靶向 敲除方法及其突变体和应用，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻抽穗期Hd6基因进行靶 向敲除，应用于早熟水稻品种的选育，获得抽穗期提前4
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12天的早熟水稻品系。本专利技术所要 解决的技术问题不限于如上所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理 解本文未提及的其它技术主题。具体技术如下：
碱基插入，第四外显子处第3737
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3744，3747
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3748位的10个碱基缺失；其位于Target site1 处核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示，位于Target site2处核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示， 氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示；
[0022]突变体M6，其在如SEQ ID NO:5所示的DNA序列第一外显子处第1178
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1179之间插入 1个碱基，第四外显子处第3729
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3747位的19个碱基缺失；其位于Target site1处核苷酸序列 如SEQ ID NO:26所示，位于Target site2处核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示；
[0023]突变体M7，其在如SEQ ID NO:5所示的DNA序列第四外显子处第3745
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3762位的18 个碱基缺失；其位于Target site1处核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示，位于Target site2处核 苷酸序列如SEQ ID NO:34所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示；
[0024]突变体M8，其在如SEQ ID NO:5所示的DNA序列第一外显子处第1168
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1177位的10 个碱基缺失，第四外显子处第3738
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3779位的42个碱基缺失，内含子3780
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4188位的339个 碱基缺失；其位于Target site1处核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示，位于Target site2处核苷 酸序列如SEQ ID NO:35所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示。
[0025]本专利技术的另一目的在于采用水稻Hd6基因靶向敲除方法进行水稻抽穗期调控。具体包括 如下步骤：
[0026]a)使用含有CRISPR/Cas9系统靶向编辑的靶位点序列的阳性质粒转入农杆菌EHA105， 采用常规农杆菌介导法转化水稻南粳46通过潮霉素筛选，再生获得转基因水稻植株；
[0027]b)采用用于筛选水稻Hd6基因的突变体的引物对(SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21)筛选纯合突变的T0代水稻植株；
[0028]c)将步骤b)筛选出的纯合突变的T0代水稻植株进行收种繁殖得T1代植株，设计T
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DNA 检测引物，筛选不携带Hpt和Cas9这两个基因的植株。
[0029]d)将步骤c)筛选出植株进行收种繁殖，并鉴定其抽穗期表型，考查其株高、千粒重、 分蘖、穗粒数、结实率、粘性属性等其他农艺性状，获得抽穗期提前的水稻突变株系，即完 成水稻抽穗期调控。
[0030]进一步地，本专利技术采用水稻Hd6基因靶向敲除方法调控的抽穗期，使水稻的抽穗期提前 4～12天。
[0031]本专利技术的有益效果：
[0032]1)本专利技术首先确定Hd6的基因功能，再根据CRISPR/Cas9靶点设计原则，在水稻Hd6 基因编码区确定CRISPR/Cas9系统编辑的靶位点，根据靶位点的序列设计引物，构建 CRISPR/Cas9
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Hd6编辑载体，用农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织，通过筛选鉴定，最后 获得7种Hd6突变的不含转基因DNA片段的早熟水稻品系。
[0033]2)本专利技术在水稻Hd6基因编码区确定了两个CRISPR/Cas9系统编辑靶位点，并本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种水稻Hd6基因功能的检测方法，其特征在于：根据日本晴的Hd6基因和Kasalath的Hd6等位基因的差异，设计PCR扩增特异性引物，扩增水稻Hd6基因，然后测序并与日本晴和Kasalath的Hd6基因序列进行比对，进而确定水稻的Hd6基因功能；所述特异性引物碱基序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。2.一种水稻Hd6基因靶向敲除方法，其特征在于：利用CRISPR/Cas9系统对水稻Hd6基因进行靶向编辑，所述CRISPR/Cas9系统靶向编辑的靶点为位于Hd6基因的第一外显子第1161
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1181处的Target site1和第四外显子第3728
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3748处的Target site2。3.根据权利要求2所述的敲除方法，其特征在于：所述靶向编辑的水稻，其Hd6基因是具有功能的。4.根据权利要求2所述的敲除方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9系统靶向敲除的靶点Target site1序列如SEQ ID NO:6所示，靶点Target site2序列如SEQ ID NO:7所示。5.根据权利要求2所述的敲除方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向所述Hd6基因靶点序列的sgRNA的载体。6.一种用于筛选水稻Hd6基因的突变体的引物对，其特征在于：该引物对为根据权利要求2或4所述的Hd6基因两个靶点Target site1和Target site2的序列设计：根据Target site1序列设计的特异性测序引物序列如SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示；根据Target site2序列设计的特异性测序引物序列如SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示。7.一种水稻Hd6基因的突变体，其特征在于：所述的突变体为采用权利要求2
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5任意一项所述的敲除方法创制，并通过权利要求6所述的引物对筛选获得。8.根据权利要求7所述的突变体，其特征在于：所述突变体为下述任意一种：突变体M0，其在如SEQ ID NO:5所示的DNA序列第一外显子处第1173
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1177位的5个碱基缺失，第四外显子处第3744
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3745之间增加一个碱基；其位于Target site1处核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，位于Target site2处核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示；突变体M2，其在如SEQ ID NO:5所示的DNA序列第一外显子处第1174
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1180位的7个碱基缺失，第四外显子处第3742
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3759位的18个碱基缺失；其位于Target site1处核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示，位于Target site2处核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示，氨基酸序列如SEQ ID...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈智慧，杨杰，陶亚军，王军，王芳权，许扬，范方军，李文奇，李霞，蒋彦婕，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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