一种细胞冻干保存剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种细胞冻干保存剂及其制备方法，该细胞冻干保存剂包括能够与生物制品活性组分的分子形成氢键的冻干保护剂，冻干保护剂包括糖类物质和用于促进糖类的保护作用的聚合物，糖类物质为海藻糖、蔗糖中的一种或两种组合，聚合物能够是白蛋白，该冻干保护剂还包括支撑物，支撑物能够为细胞提供网格状的透明的支架，使细胞能够粘附在玻片上，并保护细胞的完整性，其中，支撑物能够是低熔点琼脂糖。该细胞冻干保存剂还包括用于维持溶液pH值的冻干缓冲液、冻干缓冲液为三羟甲基氨基甲烷

【技术实现步骤摘要】
一种细胞冻干保存剂及其制备方法


[0001]本专利技术涉及医学检验
，尤其涉及一种细胞冻干保存剂及其制备方法。

技术介绍

[0002]基于细胞转染的间接荧光法(CBA)一直是自身免疫疾病的主要检测手段，利用细胞表达全长抗原蛋白，并完成蛋白折叠等蛋白修饰，能够最大程度体现抗原天然空间构象，有利于抗原和抗体反应，因此CBA法的灵敏度、特异度明显高于其他检测方法，例如Elisa。CBA法检测常见于实验室，但是做成产品需要克服细胞无法长期保存的问题。
[0003]在生物制品的冷冻干燥过程中，主要有三种效应会导致生物制品中活性组分的变性：低温效应、冻结效应和脱水效应。低温效应，生物制品中活性组分在降温与复温过程的一定温度范围内会发生变性。如对卵清蛋白(ovalbumin)的研究发现，在
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10℃～
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40℃之间，其活性显著降低，而继续降温到在
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192℃，活性几乎没有变化；冻结效应(包括离子浓度的增加、冰晶的形成与生长、pH值变化以及相分离等)，在生物制品的冻结过程中，不断结晶会导致溶液的浓度快速升高。小分子糖在最大冻结浓缩基质中的计算浓度高达80％。当溶液浓度发生变化时，离子浓度增加，促进了化学反应。在生物制品溶液在冻结过程中也会产生大量的冰
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水界面。其中活性组分分子，如蛋白质，可能会被吸附到界面上，从而可能破坏蛋白质的天然褶皱结构，最终导致蛋白质变性。在有些生物制品溶液的冻结过程中，溶液的pH值也会发生变化。如在添加有pH值为7的磷酸盐缓冲液(NaH2PO4和Na2HPO4的摩尔比为0.72)的蛋白质溶液冻结过程中，由于NaH2PO4的溶解度远远大于Na2HPO4，当溶液达到三相共晶点时，它们之间的摩尔比为57，最终导致了pH值的很大改变。蛋白质发生物理聚集和化学变性。脱水效应：水溶液中蛋白质经过充分水合作用后，在蛋白质分子表面附着一单层水，这就是所说的水合层(hydration shell)。一般来讲，参与完全水合作用的水含量为0.3～0.35g(水)/g(蛋白质)。而在冻干蛋白质产品中水的含量一般不超过10％，因此，必定有一部分结合水在干燥过程中被除去。结合水的去除很可能破坏蛋白质的天然结构，最终导致蛋白质变性。这是因为富含结合水的蛋白质在脱水过程中暴露在乏水环境中，将质子转化为带电羧酸基团，破坏了蛋白质中电荷平衡，电荷密度的降低可能促进蛋白质分子之间的疏水作用，从而使蛋白质发生聚集。
[0004]低分子量化合物：又可以分为酸性物质、中性物质和碱性物质。酸性物质主要为谷氨酸、天冬氨酸、苹果氨酸、乳酸等；中性物质主要为葡萄糖、肌醇、乳糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖、山梨醇D、L
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苏氨酸、肌醇、木糖醇等；碱性物质主要为精氨酸和组氨酸等。高分子化合物：主要如白蛋白、明胶、蛋白胨、可溶性淀粉、糊精、肉汁、果胶、阿拉伯胶、羟甲基纤维素、藻类等以及天然混合物如脱脂牛奶、血清等。一般认为，低分子化合物在冻干过程中直接发挥作用；而高分子化合物则是促进低分子化合物的保护作用。因此，制备保护剂配方时，一般多将低、高分子化合物配合使用。
[0005]冻干保护剂(lyoprotectant)：在冻结和干燥过程中，可以防止活性组分发生变性的物质，如甘油、二甲亚砜(DMSO)、海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等；
[0006]抗氧化剂(antioxidant)：用作防止生物制品在冷冻干燥过程以及贮藏过程中发生氧化变质的物质，如维生素D、维生素E、蛋白质水解物、硫代硫酸钠等，将不同的抗氧化剂混合起来使用，比单独使用时，具有更高的效力，即混合抗氧化剂具有增效的作用。
[0007]酸碱调整剂(buffer agent，PH modifier)：在冷冻干燥过程和贮藏过程中，能将生物制品的pH值调整到活性物质的最稳定区域的物质，如磷酸、山梨醇、EDTA(乙二胺四醋酸二纳)、氨基酸等。
[0008]从理论上讲，在生物制品的冷冻干燥过程中，如果糖类与生物制品活性组分的分子形成氢键而替代了原有水的位置，那么，它对这些生物制品就能够提供保护作用。实验证明，单糖(如葡萄糖、半乳糖)对蛋白质的冷冻干燥过程不能起到保护作用，这是因为单糖在冻结过程中只能提供非常微弱的稳定作用，使得蛋白质在脱水干燥前就发生了不可逆变性。而相同浓度的海藻糖在冻结过程和脱水过程中却都能提供有效的保护作用。目前的生物制品的冷冻干燥配方中，一般不单独使用单糖作为保护剂，而是经常和其它赋形剂联用。就冷冻干燥过程而言，无论还原性二糖还是非还原性二糖都具有很好的保护效果，但在生物制品冷冻干燥后的贮藏过程中，由于还原性二糖的存在会使得冻干品发生Maillard反应(蛋白质褐变反应)，最终导致冻干品发生变质。所以，在食品、药品以及生物体的冷冻干燥配方中，蔗糖和海藻糖是最常用的两种保护剂。
[0009]在生物制品的冷冻干燥全过程中，表面活性剂既能在冻结和脱水过程中降低冰水界面张力所引起的冻结和脱水变性；又能在复水过程中对活性组分起到润湿剂和重褶皱剂的作用。非离子型表面活性剂具有相对较低的临界胶束浓度(Critical Micelle Concentration，CMC)，通常使用较低浓度就可以满足保护效果。其中吐温系列是最常用的非离子型表面活性剂。
[0010]由于在蛋白质溶液的冻结过程中，溶液的浓度逐渐提高。在高浓度时可能会改变溶液的pH值，严重情况下会导致蛋白质变性，从而直接使得生物制品失活。所以，在生物制品的冻干保护剂配方中，往往要添加适量的缓冲剂。
[0011]冷冻干燥过程耗时长、耗能多，因此迫切需要对冻干循环进行优化，降低生产成本。在冻干配方中加入适量的叔丁醇(Tertiary Butyl Alcohol)后，冻结时会形成针状结晶；冰晶升华后，留下了管状通道，使水蒸汽流动阻力大大减小，升华速率显著提高。叔丁醇是一种小分子醇，分子式为(CH3)3COH，与水完全互溶，具有低毒性、高蒸汽压，既可以单独作为冻干溶剂，又可以与水组成复合溶剂，目前的研究热点是叔丁醇
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水复合溶剂。在药品水溶液中加入叔丁醇能起到以下作用：可以降低干燥层阻力，从而加速了干燥过程，缩短了干燥时间；溶解难溶于水的药品；使产品具有高的比表面积、好的外观、并易于复水；可提高药品溶液和冻干品的稳定性；有一定的抑菌作用。主要是因为不含叔丁醇时，溶液没有形成针状结晶，不利于水蒸汽的质量传递；加入叔丁醇后，形成了针状结晶，冰晶升华后，留下了管状通道，使水蒸汽的流动阻力大大减小。
[0012]现有技术中如公开号为CN109280640A的专利文献所提出的一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，包括脐带间充质干细胞的分离培养、传代及干细胞冻干粉的制备。将传代培养的细胞培养上清液抽至离心管中后冻存至固态状，再将固态状的冰冻培养基放置于使用封口膜或保鲜膜紧封的冻存瓶中，用注射器针头在封口膜或保鲜膜上扎孔，然后放置于冷冻干燥机上冷冻干燥至固体状，即制得脐带间充质干细胞冻干粉。该方法成本低，能<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞冻干保存剂，所述细胞冻干保存剂包括能够与生物制品活性组分的分子形成氢键的冻干保护剂，所述冻干保护剂包括糖类物质和用于促进糖类的保护作用的聚合物，所述糖类物质为海藻糖、蔗糖中的一种或两种组合，所述聚合物能够是白蛋白，其特征在于，所述冻干保护剂还包括支撑物，所述支撑物能够为细胞提供网格状的透明的支架，使细胞能够粘附在玻片上，并保护细胞的完整性，其中，所述支撑物能够是低熔点琼脂糖。2.根据权利要求1所述的一种细胞冻干保存剂，其特征在于，所述细胞冻干保存剂还包括用于维持溶液pH值的冻干缓冲液、所述冻干缓冲液为三羟甲基氨基甲烷
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盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、4
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羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或者多种组合。3.根据权利要求1或2所述的一种细胞冻干保存剂，其特征在于，所述冻干保护剂还包括填充剂，所述填充剂能够为细胞的活性组分提供支撑结构，其中，所述填充剂能够是多元醇。4.根据权利要求1～3任一项所述的一种细胞冻干保存剂，其特征在于，所述细胞冻干保存剂还包括用于防止冻干样品变质的防腐剂，所述防腐剂能够穿透细胞膜，进而抑制对微生物呼吸至关重要的特定酶，以达到抑制微生物活性的目的。5.根据权利要求1～4任一项所述的一种细胞冻干保存剂，其特征在于，所述冻干保护剂中，所述糖类物质与总质量的质量比为5％
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8％，所述聚合物与总质量的质量比为1％
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5％，所述多元醇与总质量的质量比为1％
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3％，所述防腐剂与总质量的质量比为0.05％，所述低熔点琼脂糖浓度为0.1％。6.根据权利要求1～5任一项所述的一种细胞冻干保存剂，其特征在于，所述细胞冻干保存剂经其和固定的细胞共孵育并真空冷冻干燥获得，其中，所述细胞为表达外源基因的HEK293T细胞或者Hela细胞。7.根据权利要求1～6任一项所述的一种细胞冻干保存剂，其特征在于，所述外源基因包括自身免疫性疾病相关抗原蛋白。8.一种基于根...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘亮，徐芳，柴国梁，
申请(专利权)人：首都医科大学宣武医院，
类型：发明
国别省市：