一种塑性包埋试剂盒及制备方法、及其应用技术

本发明专利技术公开一种塑性包埋试剂盒及制备方法、及其应用。所述试剂盒包括A液和B液，所述A液为HM20树脂，包含丙烯酸酯类单体和交联剂，所述丙烯酸酯类单体占体系总质量的82.5%，两者混合溶解；所述B液为经过提纯的偶氮二异丁腈，所述塑性包埋试剂盒中的HM20包埋树脂试剂由A液和B液混合溶解既得。本发明专利技术的包埋试剂盒及制备方法操作简单，聚合后能够较好地保持样本精细结构，聚合后硬度较高；制备方法经过较长时间实践经验，成功率高，可很好地达到预期效果。效果。

【技术实现步骤摘要】
一种塑性包埋试剂盒及制备方法、及其应用


[0001]本专利技术属于一种生物医学工程
，具体涉及一种塑性包埋试剂盒及制备方法，尤其适用要保持和可视化超微结构的生物组织塑性包埋试剂盒及制备方法、及其应用。

技术介绍

[0002]荧光标记对于研究生物组织结构、探索疾病机理有着重要的意义。树脂包埋（Resin embedding）是一项开发成熟的方法，被广泛用作为电子显微镜和光学显微镜的基础工具。例如将荧光蛋白标记或经过荧光染料染色的生物样本进行树脂包埋后结合光学成像系统如SIM
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fMOST进行切片成像可获取连续的荧光信号，重建出全脑范围的神经元投射连接模式和神经元三维精细形态。常用的树脂包埋方法种类较多，包括石蜡包埋、冰冻包埋、GMA树脂及LowicrylK4M、HM20树脂等。其中Lowicryl HM20树脂能够较快地渗透进入组织，并具有较低的自发荧光并能较好地保持组织超微结构，聚合后硬度较高，解决了切削性能差、遇水膨胀、不能连续切片等一系列问题。
[0003]目前关于Lowicryl HM20的塑性包埋试剂盒
匮乏，现有Lowicryl HM20树脂都需预处理后才可使用且制备流程繁琐、聚合方式常为紫外聚合。紫外光穿透能力较弱不适用于厚组织（＞1 mm3）生物样本，并且紫外聚合会严重淬灭样品中的荧光信号。
[0004]因此，如何兼顾解决保持样本精细结构、流程简单、荧光信号保持较佳等问题是研发Lowicryl HM20的塑性包埋试剂盒的重要关键因素。

技术实现思路
<br/>[0005]有鉴于此，本专利技术的目的是提出一种能适用要保持和可视化超微结构的生物组织塑性包埋试剂盒及制备方法、及其应用。
[0006]本专利技术提供了一种塑性包埋试剂盒，包括A液（包埋剂）和B液（引发剂），所述A液为HM20树脂，包含丙烯酸酯类单体和交联剂，所述丙烯酸酯类单体占体系总质量的82.5%，所述交联剂占体系总质量的17.5%，两者混合溶解；所述B液为经过提纯的偶氮二异丁腈（AIBN），所述塑性包埋试剂盒中的HM20包埋树脂试剂由A液（包埋剂）和B液（引发剂）混合溶解既得。
[0007]优选的，所述交联剂为三乙二醇二甲基丙烯酸酯。
[0008]优选的，100%浓度的所述HM20包埋树脂试剂中，所述由A液（包埋剂）和B液（引发剂）的质量比为2500:4，其余浓度的所述HM20包埋树脂试剂使用无水乙醇稀释。
[0009]本专利技术所述的塑性包埋试剂盒的制备方法，分别制备A液（包埋剂）和B液（引发剂），再将所述A液和B液按比例混合溶解既得，所述A液的制备方式为：首先使用玻璃层析柱对丙烯酸酯类单体和交联剂分别进行过滤，在层析柱的出口处塞入些许脱脂棉，加入碱性氧化铝粉末，盖上塞子缓慢通入氮气，滤除树脂中阻聚剂，再将所述丙烯酸酯类单体和交联剂按比例混合溶解既得；所述B液的制备方式为：首先使用冷凝管、锥形瓶、80℃水浴加热95%高浓度酒精，
立刻加入偶氮二异丁腈，摇荡使其溶解，立刻抽滤，待冷却12
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25小时后得到白色偶氮二异丁腈晶体，用漏斗抽滤，存于棕色器皿中干燥至少24小时，后置于真空烘箱中干燥24小时既得。
[0010]优选的，100%浓度的所述HM20包埋树脂试剂将所述A液和B液按2500:4的质量比混合溶解既得，其余浓度的所述HM20包埋树脂试剂使用无水乙醇稀释。
[0011]本专利技术所述的塑性包埋试剂盒的应用，制成HM20包埋树脂试剂明胶胶囊，适用于不同尺寸生物组织，直径分别为9.55mm、8.18mm、13mm等。
[0012]本专利技术所述的塑性包埋试剂盒的应用，具体步骤：对生物样本进行预处理；对预处理后的生物样本进行梯度脱水和梯度浓度渗透；将渗透处理后的生物样本置于明胶胶囊，随后在胶囊中缓慢加入所述100%浓度的所述HM20包埋树脂试剂，使其充满胶囊，随后在38
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50℃条件下加热聚合24
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48小时。
[0013]优选的，对生物样本进行预处理包括：将生物样本在4℃预冷却的多聚甲醛固定液中固定24
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48小时；将固定好的生物样本在漂洗液中漂洗12
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24小时。
[0014]优选的，对预处理后的生物样本进行梯度脱水和梯度浓度渗透包括，将所述漂洗好的生物样本依次放入4℃预冷却的50%、70
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75%和85
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95%乙醇和无水乙醇中进行梯度脱水，每个梯度1
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2小时；完成脱水处理后，进行梯度浓度渗透，具体包括将试剂盒中A液和B液按比例混合搅拌30min既得100%浓度的HM20包埋树脂试剂，所述丙烯酸酯类单体占体系总质量的82.5%，使用无水乙醇稀释所述100%浓度的HM20包埋树脂试剂，获取梯度浓度的HM20包埋树脂试剂，分别为第一梯度50%、第二梯度70%
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75%、第三梯度100%；将所述梯度脱水后的生物样本，依次放入4℃预冷却的分别为50%、70%
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75%、100%浓度的HM20包埋树脂试剂中，每个梯度2
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24小时，置换乙醇溶液，使包埋剂完全渗透入生物样本中。
[0015]本专利技术的有益效果主要体现在：（1）本专利技术的HM20包埋试剂盒及制备方法操作简单，聚合后能够较好的保持样本精细结构，聚合后硬度较高；（2）制备方法经过较长时间实践经验，成功率高，可很好地达到预期效果；（3）本专利技术A、B液的特定配比是为了实现树脂充分聚合（避免聚合不充分或过度聚合），以保持组织形态和结构；并使得聚合后的组织具有一定的硬度，以实现高质量的亚微米厚度连续切片；（4）适用性广，对于组织精细结构能够很好地保存，包括不限于脑组织轮廓、神经元、血管等。
附图说明
[0016]图1为使用本专利技术包埋试剂盒包埋的小鼠脑样本试剂盒包埋形态轮廓成像图；图2为使用本专利技术包埋试剂盒包埋的绿色荧光蛋白标记小鼠脑神经元样本试剂盒
包埋精细结构成像图；图3为使用本专利技术包埋试剂盒包埋的绿色荧光蛋白标记小鼠脑血管样本试剂盒包埋精细结构成像图。
具体实施方式
[0017]为了使本领域技术人员更好的使用和理解本专利技术的技术方案，结合具体的实施方式作进一步的详细说明。所用试剂或仪器未注明生产商，均可通过市场售卖获得。
[0018]名词解释HM20树脂：丙烯酸酯类树脂本专利技术提供了一种塑性包埋试剂盒，包括A液（包埋剂）和B液（引发剂）。本专利技术中试剂盒密封、避光4℃保存。
[0019]所述A液为HM20树脂，按质量百分数组成包括：82.5%丙烯酸酯类单体、17.5%交联剂。两者混合溶解，所述交联剂为三乙二醇二甲基丙烯酸酯。选取三乙二醇二甲基丙烯酸酯的原因：交联剂和树脂单体在引发剂作用下发生聚合，形成三维聚合网络，该配比下，聚合后的树脂具有较高硬度，后续实施例中可以看到硬度在80
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82，有利于获取高质量的薄切片，获取精细结构高清晰的荧光图像。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种塑性包埋试剂盒，其特征在于：包括A液和B液，所述A液为HM20树脂，包含丙烯酸酯类单体和交联剂，所述丙烯酸酯类单体占体系总质量的82.5%，所述交联剂占体系总质量的17.5%，两者混合溶解；所述B液为经过提纯的偶氮二异丁腈，所述塑性包埋试剂盒中的HM20包埋树脂试剂由A液和B液混合溶解既得。2.根据权利要求1所述的塑性包埋试剂盒，其特征在于，所述交联剂为三乙二醇二甲基丙烯酸酯。3.根据权利要求1所述的塑性包埋试剂盒，其特征在于，100%浓度的所述HM20包埋树脂试剂中，所述由A液和B液的质量比为2500:4，其余浓度的所述HM20包埋树脂试剂使用无水乙醇稀释。4.根据权利要求1至3任一所述的塑性包埋试剂盒的制备方法，其特征在于，分别制备A液和B液，再将所述A液和B液按比例混合溶解既得，所述A液的制备方式为：首先使用玻璃层析柱对丙烯酸酯类单体和交联剂分别进行过滤，在层析柱的出口处塞入些许脱脂棉，加入碱性氧化铝粉末，盖上塞子缓慢通入氮气，滤除树脂中阻聚剂，再将所述丙烯酸酯类单体和交联剂按比例混合溶解既得；所述B液的制备方式为：首先使用冷凝管、锥形瓶、80℃水浴加热95%高浓度酒精，立刻加入偶氮二异丁腈，摇荡使其溶解，立刻抽滤，待冷却12
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25小时后得到白色偶氮二异丁腈晶体，用漏斗抽滤，存于棕色器皿中干燥至少24小时，后置于真空烘箱中干燥24小时既得。5.根据权利要求4所述的塑性包埋试剂盒的制备方法，其特征在于，100%浓度的所述HM20包埋树脂试剂将所述A液和B液按2500:4的质量比混合溶解既得，其余浓度的所述HM20包埋树脂试剂使用无水乙醇稀释。6.根据权利要求1所述的塑性包埋试剂盒的应用，其特征在于，制成HM20包埋树脂试剂明胶胶囊。7.根据权利要求6所述的塑性包埋试剂盒的应用，其特征在于，适用于不同尺寸生物组织，直径...

【专利技术属性】
技术研发人员：李向宁，任淼，龚辉，
申请(专利权)人：华中科技大学苏州脑空间信息研究院，
类型：发明
国别省市：