一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法及其在催化黄酮苷类化合物上的应用技术

本发明专利技术公开了一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法及其在催化黄酮苷类化合物上的应用。以大肠杆菌为原始菌株，分别扩增并构建生物被膜形成关键基因的过表达质粒并转入原始菌株获得过表达菌株，辅以改性聚氨酯纤维作为生物被膜载体，从菌株和载体两个方面加速生物被膜的生长并提高生物被膜的产量，从而改善其催化性能。本发明专利技术方法制备的生物被膜的催化效率高催化性能稳定，为其在工业生产领域的应用提供了条件。应用提供了条件。应用提供了条件。

【技术实现步骤摘要】
一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法及其在催化黄酮苷类化合物上的应用
[0001]

[0002]本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法及其在催化黄酮苷类化合物上的应用。

技术介绍

[0003]生物被膜是指细菌附着在有生命或非生命的载体表面，分泌大量胞外聚合物，将自身包绕在其中而形成的结构化群落。在工业生产过程中，生物被膜具有自我再生、可持续和可扩展等诸多优势，具有巨大的应用潜力（Trends Biotechnol, 2009, 27(11): 636
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643.）。然而，由于生物被膜生长慢、产量低等问题，限制了其实际应用效果。因此，加速工程菌生物被膜生长，提高生物被膜产量，是改善其工业催化性能的基础。
[0004]生物被膜的形成是一个广泛、动态、复杂的过程，是多因素共同作用的结果。其中，胞外聚合物是生物被膜的骨架，细菌通过分泌胞外聚合物以维持生物被膜的稳定性和完整性（PNAS, 2015, 112(36): 11353
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11358.）；鞭毛和菌毛赋予了细菌粘附和运动性能，调节细菌的趋化和表面附着等行为，控制浮游菌向生物被膜过渡（Poultry Sci, 2022, 101(4): 101757.）；群体感应系统中大肠杆菌通过分泌信号分子AI
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2调控包括生物被膜形成、抗生素合成在内的群体行为，使菌群在复杂的环境中能够协调一致，提高了抗逆性和环境适应性（Sci Adv, 2018, 4(6): r7063.）。CN110467252A公开了一种基于群体感应系统调控生物被膜形成的方法，通过优化群体感应信号分子类型和添加量，以提高污水处理生物膜形成速度和稳定性；CN111548955A公开了一种促进枯草芽孢杆菌生物被膜形成的方法，通过敲除枯草芽孢杆菌生物被膜抑制基因，以提高其生物被膜产量。目前，还未有报道比较分析胞外聚合物分泌基因、细菌运动性基因和群体感应相关基因对生物被膜形成的影响，用于筛选成膜能力强的菌株。因此，通过构建上述基因的过表达菌株，有望获得生物被膜形成能力强的菌株，从而增大生物被膜形成速度与产量。
[0005]载体为细菌提供了栖息安居地场所，是生物被膜生长的基础组成元件。载体性质直接影响细菌的粘附、生物被膜的发展和反应器系统的催化效果。合适的载体不仅有助于生物被膜的附着、生长、增殖和更新，而且可以增加其在相同体积系统中的生物总量，进一步提高反应器的催化效率。研究表明，载体与细菌的润湿性差异是相互作用的驱动力，即两者润湿性的差异越大，越有利于细菌在载体表面的附着生长（Environ Technol Inno, 2021, 21:101233.）。CN112960766A公开了一种好氧生物被膜材料、制备方法，在发泡的过程中加入氧化海藻酸钠粉末作为填充物，大大提高了多孔聚氨酯泡沫颗粒的亲水性能和生物相容性能；CN107252680A公开了一种生物被膜载体的制备方法，通过在载体表面改性形成羟基磷酸钙膜层，提高载体表面湿润性，降低了微生物的附着难度，缩短了挂膜时间。然而，迄今还未有报道将强化菌株自身成膜能力与改性载体相结合，用于培植生物被膜催化
剂。因此将两者相结合，从菌株和载体两个方面同时提高生物被膜形成速度和产量，对改善生物被膜催化性能具有重要意义。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中大肠杆菌的生物被膜生长慢、产量低的问题，本专利技术提供一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法及其在催化黄酮苷类化合物上的应用，通过将过表达生物被膜形成关键基因与载体改性相结合，加速大肠杆菌生物被膜的生长，提高其产量，并应用于催化黄酮苷类化合物转化，从而提高其在工业生产中的应用潜力。
[0007]为解决现有技术问题，本专利技术采取的技术方案为：一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法，包括以下步骤：步骤1，扩增生物被膜形成关键基因，构建含有生物被膜形成关键基因质粒的重组质粒，再将重组质粒转入重组大肠杆菌体内，构建得到生物被膜形成能力强的过表达菌株；步骤2，对生物被膜载体材料进行改性处理，并将改性后的材料填充于组培瓶中，添加LB培养基，再接入过表达菌株，培养形成生物被膜；步骤3，向形成的生物被膜中添加诱导剂IPTG，调节培养温度，诱导生物被膜表达α
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鼠李糖苷酶RhaB1。
[0008]作为改进的是，所述的生物被膜形成关键基因为群体感应基因、胞外聚合物分泌基因或运动性基因。
[0009]作为改进的是，所述群体感应基因为信号分子合成蛋白基因luxS，信号分子结合蛋白基因lsrB，或细菌密度调控子酸性磷酸酶基因aphA，所述胞外聚合物分泌基因为脂多糖合成蛋白基因rfaP，胞外多糖合成亚基基因pgaA，纤维素合成酶基因bcsA，或膜外多糖输出蛋白基因wza；所述运动性基因为卷曲菌毛合成蛋白基因csgD，菌毛粘附素基因fimC或鞭毛运动蛋白基因motB。
[0010]luxS基因片段序列：ATGCCGTTGTTAGATAGCTTCACAGTCGATCATACCCGGATGGAAGCGCCTGCAGTTCGGGTGGCGAAAACAATGAACACCCCGCATGGCGACGCAATCACCGTGTTCGATCTGCGCTTCTGCGTGCCGAACAAAGAAGTGATGCCAGAAAGAGGGATCCATACCCTGGAGCACCTGTTTGCTGGTTTTATGCGTAACCATCTTAACGGTAATGGTGTAGAGATTATCGATATCTCGCCAATGGGCTGCCGCACCGGTTTTTATATGAGTCTGATTGGTACGCCAGATGAGCAGCGTGTTGCTGATGCCTGGAAAGCGGCAATGGAAGACGTGCTGAAAGTGCAGGATCAGAATCAGATCCCGGAACTGAACGTCTACCAGTGTGGCACTTACCAGATGCACTCGTTGCAGGAAGCGCAGGATATTGCGCGTAGCATTCTGGAACGTGACGTACGCATCAACAGCAACGAAGAACTGGCACTGCCGAAAGAGAAGTTGCAGGAACTGCACATCTAGlsrB基因片段序列：ATGACACTTCATCGCTTTAAGAAAATCGCCTTACTTAGCGTTCTTGGCATTGCCGCAATCTCTATGAATGTGCAGGCCGCAGAGCGTATTGCATTTATTCCCAAACTGGTTGGCGTGGGATTTTTTACCAGCGGTGGCAACGGCGCACAACAAGCGGGTAAAGAGCTGGGCGTTGATGTGACCTACGACGGGCCGACAGAACCCAGTGTTTCTGGTCAGGTACAGTTGATTAATAACTTCGTCAATCAAGGTTATAACGCCATTATCGTTTCTGCGGTTTCGCCTGATGGCTTGTGTCCGGCACTGAAACGCGCCATGCAACGTGGTGTGAGAGTGCT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，扩增生物被膜形成关键基因，构建含有生物被膜形成关键基因质粒的重组质粒，再将重组质粒转入重组大肠杆菌体内，构建得到生物被膜形成能力强的过表达菌株；步骤2，对生物被膜载体材料进行改性处理，并将改性后的材料填充于组培瓶中，添加LB培养基，再接入过表达菌株，培养形成生物被膜；步骤3，向形成的生物被膜中添加诱导剂IPTG，调节培养温度，诱导生物被膜表达α
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鼠李糖苷酶RhaB1。2.根据权利要求1所述的一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法，其特征在于，所述的生物被膜形成关键基因为群体感应基因、胞外聚合物分泌基因或运动性基因。3.根据权利要求2所述的一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法，其特征在于，所述群体感应基因为luxS、lsrB或aphA，所述胞外聚合物分泌基因为rfaP、pgaA、bcsA或wza；所述运动性基因为csgD、fimC或motB。4.根据权利要求1所述的一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法，其特征在于，步骤2中所用的改性剂为质量分数0.01
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50%的重铬酸钾溶液，改性处理得时间为0.1
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【专利技术属性】
技术研发人员：王俊，陈欢，颜承海，詹彧繁，宫璐婵，游帅，吴福安，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：