一种仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF-8及其应用制造技术

本发明专利技术属于酶联免疫分析技术领域，具体涉及一种仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF

【技术实现步骤摘要】
一种仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF
‑
8及其应用


[0001]本专利技术属于酶联免疫分析
，具体涉及一种仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF
‑
8及其应用。

技术介绍

[0002]双酚A(BPA)是一种常见的内分泌干扰物，目前已被广泛应用于各种消费品中，尤其是婴儿用品。研究表明，BPA是一种具有生殖毒性的有机污染物，BPA的长期低剂量暴露会影响人体性激素的正常功能，可能导致睾丸萎缩、生殖道畸形甚至不育等。它的广泛使用/滥用，可对人们的健康造成严重的危害。因此，针对BPA建立高灵敏度、快速的分析检测方法，明确该类化合物在环境中的分布状况和污染水平是十分有必要的。
[0003]基于抗体的酶联免疫分析法具有快速、简单、高通量的特点，在环境中新型有机污染物的分析检测方面具有广泛的应用前景。由于其高效的催化活性，辣根过氧化物酶(HRP)常被用作传统酶联免疫分析法的抗体标记物，但其制备成本高、稳定性差、易变性等缺点也限制了酶联免疫分析法在复杂样品检测中的分析性能。近年来，具有类酶催化作用的纳米酶的合成与应用成为了各个研究领域的热点，也为HRP替代物的开发提供了一种新策略。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术目的在于提供一种仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF
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8及其应用。本专利技术基于金属有机框架材料ZIF
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8制备具有类过氧化物酶催化活性的仿生纳米酶，并以此作为BPA抗体标记物，构建一种间接竞争酶联免疫分析法。放大检测信号，提高BPA的检测效率，具有良好的应用前景。
[0005]为达到以上目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供了一种Hemin@BSA@ZIF
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8的制备方法，包括如下步骤：（1）BSA 溶于水中得到溶液A，氯化血红素溶于二甲亚砜中得到溶液B；将溶液A，溶液B和水混合后孵育反应；反应产物置于超纯水中透析，得到Hemin@BSA；（2）将步骤（1）Hemin@BSA加入到Zn(CH3COO)2·
2H2O溶液中，持续搅拌加入2
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甲基咪唑溶液，搅拌后洗涤产物，离心、真空干燥得到Hemin@BSA@ZIF
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8。
[0006]进一步，步骤（1）中所述溶液A的浓度为1~2 mg/mL，所述溶液B的浓度为1 mg/mL；所述溶液A、溶液B和水的体积比为4：1：3。
[0007]步骤（1）中所述孵育反应的条件为25~37℃，反应30~40 min。
[0008]步骤（1）中所述透析的时间为36~48 h。
[0009]步骤（2）中所述Zn(CH3COO)2·
2H2O的浓度为40 mM，2
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甲基咪唑溶液的浓度为160 mM；所述Hemin@BSA、Zn(CH3COO)2·
2H2O和2
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甲基咪唑溶液的体积比为1~3：1：1。
[0010]步骤（2）中所述洗涤为用甲醇和SDS溶液洗涤2次以上，洗涤时间为10~15 min/次。
[0011]本专利技术还提供了上述制备方法制备的仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF
‑
8。
[0012]本专利技术还提供了上述的仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF
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8在BPA检测领域中的应用。
[0013]本专利技术还提供了一种间接竞争酶联免疫分析法的构建方法，具体包括步骤：（1）将Hemin@BSA@ZIF
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8和PBS溶液在常温下磁力搅拌至完全溶解后加入BPA抗体，恒温搅拌得到BPA抗体标记物Hemin@BSA@ZIF
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8@Ab；（2）抗原包被：将BPA包被原用CBS包被缓冲液稀释至工作液浓度1:8000，包被于96孔板上，4℃过夜或37℃两小时孵育；孵育结束后，甩干酶标板，用含有0.05 % Tween
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20的PBS溶液洗板3
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5次，拍干备用；（3）封闭：使用封闭缓冲液对步骤（2）中得到的酶标板进行封闭，恒温孵育1
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2 h；孵育结束后甩干酶标板，洗板、拍干备用；（4）BPA抗体标记物/标准品或样品竞争反应：使用抗体稀释液将步骤（1）得到的BPA抗体标记物稀释至工作浓度1:4；根据所设置标准曲线检测范围，稀释BPA标准储备液；然后将BPA抗体标记物溶液和标准品/样品溶液等体积加入酶标板中，空白对照组加BPA抗体标记物溶液和等体积PBS缓冲液，恒温孵育；孵育结束后甩干酶标板，洗板、拍干备用；（5）显色反应：步骤（4）反应结束加入含有TMB和H2O2的底物缓冲液，继续恒温孵育；显色后，向每孔中加入H2SO4溶液，终止反应，使用多功能酶标仪读取450 nm波长下吸光度值；（6）原始数据处理：对原始数据进行初步处理，以BPA标准品浓度为横坐标，以不同浓度BPA对应的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，利用Origin 2021软件拟合标准曲线。
[0014]进一步地，步骤（1）中所述Hemin@BSA@ZIF
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8、PBS溶液和BPA抗体的用量比例关系为：1.25 mg：1 mL：1~5μL；所述BPA抗体的浓度为1.9 μg/mL。
[0015]步骤（3）中所述封闭缓冲液中含有明胶的CBS溶液；明胶的质量分数为1%；所述封闭缓冲液的用量为200 μL/孔。
[0016]步骤（4）中所述的抗体稀释液为含有0.01 % tween
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20和0.1%明胶的PBS缓冲液。
[0017]步骤（5）中所述底物缓冲液为含有TMB和H2O2的水溶液；所述底物缓冲液中TMB、H2O2、H2O的体积比为2μL: 1μL:7μL。
[0018]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术合成了一种基于金属有机框架材料（ZIF
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8）的仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF
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8。与传统的多孔材料相比， ZIF
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8多孔内腔中独特的限域效应有利于提高底物或中间体的扩散效率，在其空腔内形成多重循环反应，从分子层面改善内部催化剂的表观催化性能，具有高效的类过氧化物酶催化活性。 同时，ZIF
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8高度的结晶性提供一个刚性结构，保护其免受外部环境的破坏，避免催化剂中毒或失活，具有很好的稳定性。本专利技术以仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF
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8作为BPA抗体标记物，待测目标物的特异性抗体通过静电吸附作用偶联到Hemin@BSA@ZIF
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8上，形成具有信号放大作用的纳米酶
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抗体标记物；利用抗原
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抗体的特异性识别，加入目标物，通过目标物和抗原的竞争作用，进而构建一种间接竞争酶联免疫分析法。用于检测环境样本中的BPA。与现有检测方法相比，Hemin@BSA@ZIF
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8可放大检测信号，有效避免如环境温度、pH值、离子强度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF
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8的制备方法，包括如下步骤：（1）BSA 溶于水中得到溶液A，氯化血红素溶于二甲亚砜中得到溶液B；将溶液A、溶液B和水混合后孵育反应；反应产物置于超纯水中透析，得到Hemin@BSA；（2）将步骤（1）得到的Hemin@BSA加入到Zn(CH3COO)2·
2H2O溶液中，持续搅拌加入2
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甲基咪唑溶液，搅拌后洗涤产物，离心、真空干燥得到Hemin@BSA@ZIF
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8。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述溶液A的浓度为1~2 mg/mL，溶液B的浓度为1 mg/mL；所述溶液A、溶液B和水的体积比为4：1：3。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述孵育反应的条件为25~37℃，反应30~40 min；所述透析的时间为36~48 h。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述Zn(CH3COO)2·
2H2O的浓度为40 mM，2
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甲基咪唑溶液的浓度为160 mM；所述Hemin@BSA、Zn(CH3COO)2·
2H2O和2
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甲基咪唑溶液的体积比为1~3：1：1。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述洗涤为用甲醇和SDS溶液洗涤2次以上，洗涤时间为10~15 min/次。6.根据权利要求1~5任一项所述的制备方法制备的仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF
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8。7.权利要求6所述的仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF
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8在BPA检测领域中的应用。8.一种间接竞争酶联免疫分析法的构建方法，其特征在于，具体包括步骤：（1）将Hemin@BSA@ZIF
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8和PBS溶液在常温下磁力搅拌至完全溶解后加入BPA抗体，恒温搅拌得到BPA抗体标记物Hemin@BSA@ZIF<...

【专利技术属性】
技术研发人员：张祯，朱暖飞，肖佳轩，韦达理，熊定辉，王玥，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：