基于结构的靶向RNA发夹环的治疗剂的设计制造技术

本发明专利技术提供了可以用于简单且快速地确定RNA发夹环及其与抑制剂的复合物的三维结构的方法和材料。支架RNA，来自假乙醇热厌氧杆状菌(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)的YdaO型c

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于结构的靶向RNA发夹环的治疗剂的设计
[0001]对相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求根据35U.S.C.第119(e)节的2019年11月19日提交并且题为“基于结构的靶向RNA发夹环的治疗剂的设计”的共同未决和共同转让的美国临时专利申请序列号62/937,657的权益，该申请通过引用并入本文。
[0003]政府支持声明
[0004]本专利技术是在政府支持下完成的，资助号为1616265，由美国国家科学基金会授予。政府对本专利技术享有一定的权利。


[0005]本专利技术涉及用于确定RNA发夹环的三维结构的方法和材料。

技术介绍

[0006]RNA分子对于许多疾病，诸如癌症和RNA病毒感染的发展至关重要。为此，RNA分子是极好的治疗靶标。在这种情况下，几乎所有的RNA形成对其功能至关重要的发夹二级结构。因此，有必要了解这些结构以促进靶向这些分子的治疗剂的识别和设计。然而，检查RNA的常规方法，诸如RNA干扰和反义寡核苷酸，是有限的，并且避开了强结构。虽然常规技术可以提供一些关于RNA结构的信息，但这些技术的局限性使得RNA发夹环对于治疗性抑制剂设计中来说是不受重视的靶标。
[0007]该
迫切需要用于获得有关RNA发夹环三维结构信息的新方法和新材料。

技术实现思路

[0008]如下文详述，我们开发了新的支架定向晶体学方法，其可用于获得有关RNA发夹环的三维结构的信息。本文公开的RNA结晶支架和相关方法可以用于简单且快速地确定RNA发夹环的三维结构以及它们与其他试剂(例如抑制剂)的关联。本专利技术方法中使用的特定支架RNA是来自假乙醇热厌氧杆状菌(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)的YdaO型c
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di
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AMP核糖开关，发现该RNA容易形成具有直径超过的大腔的晶体。正如下面详细讨论的，我们已经确定可以将感兴趣的RNA工程化改造到该支架RNA的P2茎中，以便将发夹容纳在腔中。然后可以在与使单独的支架结晶的条件相似或不相关的条件下使所得的融合RNA结晶。然后可以使用X射线或电子晶体学技术等来确定此类分子(例如这些分子单独和/或与其他试剂缔合)的三维结构。
[0009]本文公开的RNA结晶支架和相关方法可以用于鉴定以高亲和力和特异性与靶RNA分子相互作用的化合物，诸如天然和化学修饰的寡核苷酸，以及小分子药物。这很重要，因为此类化合物与RNA发夹环之间的相互作用可以以可以在病理学，诸如癌症和RNA病毒感染中调节它们在体内的活性的方式影响这些分子的生物活性。此外，由于RNA几乎涉及生物学和疾病的每个方面，因此本文公开的方法是广泛适用的规程，可以提供有关如何特异性调节几乎任何靶RNA的信息。因此，本文公开的方法允许观察和评估靶向特定RNA的试剂，诸如
寡核苷酸类似物，包括在多种生物过程中起作用的试剂，诸如涉及病毒复制(例如病原体诸如严重急性呼吸综合征冠状病毒2、丙型肝炎和寨卡的复制)的过程，涉及病理状况诸如癌症或神经退行性疾病的过程，以及涉及产生用于调节蛋白质编码基因的microRNA的过程等。
[0010]本文公开的本专利技术具有多个实施方案。本专利技术的一个实施方案是物质组合物，其包含与以下具有至少90％序列同一性的核糖核酸：GGUUGCCGAAUCCGAAAGGUACGGAGGAACCGCUUUUUGGGGUUAAUCUGCAGUGAAGCUGCAGUAGGGAUACCUUCUGUCCCGCACCCGACAGCUAACUCCGGAGGCAAUAAAGGAAGGAG(SEQ ID NO：1)。通常，多核苷酸包含SEQ ID NO：1的序列。在该组合物中，核糖核酸的SEQ ID NO：1的残基14
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17(GAAA)用长度在4到33个核苷酸之间的核酸的异源区段替换(上述至少90％的序列同一性不包括可以在残基14
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17处插入该核糖核酸中的核酸的异源区段)。在这些组合物中，核酸的异源区段通常是在天然存在的RNA分子中形成环结构的核酸区段。在本专利技术的某些实施方案中，核酸的异源区段包括天然存在的RNA分子中的完整的环结构，以及任选地茎结构的0
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5个碱基对。任选地，这些组合物可以进一步包含与核糖核酸结合的试剂，例如与核糖核酸杂交的多核苷酸。
[0011]本专利技术的另一个实施方案是用于观察包含质粒的RNA结构的系统或试剂盒，该质粒包含编码与以下具有至少90％(并且任选地小于100％)同一性的核糖核酸的DNA序列：GGUUGCCGAAUCCGAAAGGUACGGAGGAACCGCUUUUUGGGGUUAAUCUGCAGUGAAGCUGCAGUAGGGAUACCUUCUGUCCCGCACCCGACAGCUAACUCCGGAGGCAAUAAAGGAAGGAG(SEQ ID NO：1)。在某些实施方案中，质粒进一步包含用于表达或转录核糖核酸的启动子，和/或系统或试剂盒进一步包含RNA聚合酶。任选地，该系统或试剂盒进一步包含与质粒中的一段核酸杂交的一种或多种引物。
[0012]本专利技术的又一个实施方案是获得关于核糖核酸结构的信息的方法。该方法包括将SEQ ID NO：1(或与SEQ ID NO：1具有至少90％的核糖核酸)的残基14
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17(GAAA)用长度在4至33个核苷酸之间的核酸的异源区段替代，以形成融合核糖核酸分子，使融合RNA结晶，对融合核糖核酸分子进行X射线或电子晶体学技术，以便观察结果(例如X射线或电子晶体学技术的电子密度图)以获得关于核酸的异源区段的三维结构的信息。在这些方法的某些实施方案中，在晶体学分析之前将融合核糖核酸分子与结合核糖核酸的试剂(例如与核糖核酸杂交的多核苷酸)组合，使得RNA/试剂复合物的结构可以被观察。通常在这些方法中，晶体学分析包括与缺乏与核糖核酸结合的试剂的对照样品进行比较。任选地，在这些方法中，在X射线或电子晶体学技术之前，将多个融合核糖核酸分子与多种与核糖核酸结合的试剂组合(例如在高通量筛选中)。在本专利技术的一些实施方案中，将至少两种试剂与融合核糖核酸分子组合。
[0013]在本专利技术的说明性工作实施方案中，我们检查了pri
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miRNA发夹环的九种结构。这些研究确定，长度为4
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8个核苷酸的环比以前认为的更结构化，使这些和中等长度的环成为治疗剂的优秀靶标。在本专利技术的实施方案中，靶环不必具有特定长度，并且可以比可用示例更长或更短。这种认识和我们新的结构确定方法允许工匠能够鉴定先导寡核苷酸化合物，并快速且经济高效地进行基于结构的迭代轮次。本专利技术的方法具有广泛的应用，因为它们靶向对对抗传染病和癌症、年龄相关的病理和神经退行性疾病以及遗传病症诸如DiGeorge综合征等很重要的过程。
[0014]本专利技术的其他目的、特征和优点对于本领域技术人员来说将从以下详细描述中变
得显而易见。然而，应当理解的是，详细描述和具体实施例虽然指示了本专利技术的一些实施方案，但以说本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.物质组合物，其包含与以下具有至少90％序列同一性的核糖核酸：GGUUGCCGAAUCCGAAAGGUACGGAGGAACCGCUUUUUGGGGUUAAUCUGCAGUGAAGCUGCAGUAGGGAUACCUUCUGUCCCGCACCCGACAGCUAACUCCGGAGGCAAUAAAGGAAGGAG(SEQ ID NO:1)，其中：所述核糖核酸的残基14
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17(GAAA)经长度在4到33个核苷酸之间的核酸的异源区段替换。2.权利要求1所述的组合物，其进一步包含结合至所述核糖核酸的试剂。3.权利要求2所述的组合物，其中所述试剂是与所述核糖核酸杂交的多核苷酸。4.权利要求1所述的组合物，其中所述核酸的异源区段在天然存在的RNA分子中形成环结构。5.权利要求4所述的组合物，其中所述核酸的异源区段包括所述天然存在的RNA分子中完整的环结构，以及任选地茎结构的0
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5个碱基对。6.用于观察RNA结构的系统/试剂盒，其包含：质粒，其包含编码与以下具有至少90％同一性的核糖核酸的DNA序列：GGUUGCCGAAUCCGAAAGGUACGGAGGAACCGCUUUUUGGGGUUAAUCUGCAGUGAAGCUGCAGUAGGGAUACCUUCUGUCCCGCACCCGACAGCUAACUCCGGAGGCAAUAAAGGAAGGAG(SEQ ID NO:1)。7.权利要求6所述的系统/试剂盒，其进一步包含用于表达所述核糖核酸的启动子。8.权利要求7所述的系统/试剂盒，其进一步包含RNA聚合酶。9.权利要求6所述的系统/试剂盒，其进一步包含与所述质粒中的核酸段杂交的一种或多种引物。10.获得关于核糖核酸的结构的信息的方法，其包括：获得与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的核糖核酸；将对应于SEQ ID NO:1中环残基14
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17(GAAA)的残基用长度在4至33个核苷酸之间的核酸的异源区段取代，以形成融合核糖核酸分子；使所述融合核糖核酸分子结晶；对所述融合核糖核酸分子进行X射线或电子晶体学技术；和观察所述X射线或电子晶体学技术的结果，从而获得关于所述核酸的异源区段的结构的信息。11.权利要求10所...

【专利技术属性】
技术研发人员：F郭，G肖夫纳，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：