一种核酸内切酶及其纯化方法和应用技术

本发明专利技术公开一种核酸内切酶及其纯化方法和应用。所述的核酸内切酶包含GajA蛋白和识别标签。编码GajA蛋白的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO.1，识别标签为组氨酸标签、FLAG标签、HA标签、SBP标签、Avi标签、Nus标签、V5标签中的任意一种，GajA蛋白的氨基端与所述识别标签连接。本发明专利技术提供的核酸内切酶是一个全新的具有序列识别特异性的缺刻内切酶，而且根据识别序列的不同，可同时作为限制性内切酶和缺刻内切酶发挥作用。因此，该酶可广泛应用于DNA加工、基因编辑、基因工程等领域。另外，核酸内切酶的活性受核苷酸的负调控，拓展了该酶的应用。拓展了该酶的应用。拓展了该酶的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸内切酶及其纯化方法和应用


[0001]本专利技术属于核酸内切酶
，特别涉及核酸内切酶及其纯化方法和应用。

技术介绍

[0002]核酸内切酶(endonuclease)是一类广泛存在于生物体内的核酸水解酶，可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸。从对底物的特异性来看，核酸内切酶可分为DNaseⅠ、DNaseⅡ等分解DNA的酶，以及RNase、RNaseT1等分解RNA的酶。一般来说，大都不具碱基特异性，但也有能够识别并切断特定的碱基或碱基序列的酶。所以，把用来识别特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类核酸内切酶，称为限制性核酸内切酶，简称限制酶。根据限制酶的结构、辅因子的需求、切割位点与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型(Type I)、第二型(Type II)、第三型(Type III)及第四型(Type IV)。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解，需要ATP，切割位点与识别位点间的间距不定；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解，具有特异性的识别序列，切割位点位于识别序列内或邻近识别序列。Ⅲ型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用，需要ATP。IV型限制性内切酶仅切割甲基化的DNA，切割位点大约距离识别位点30bp。其中，Type II型限制性内切酶被广泛应用于生物科学的研究，使基因重组技术成为可能，是基因工程的基础。限制性内切酶可用于DNA基因组物理图谱的组建、基因的定位和基因分离、DNA分子碱基序列分析、比较相关的DNA分子和遗传工程、DNA加工和基因工程等领域。限制性核酸内切酶是由细菌产生的，限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA，其生理意义是提高自身的防御能力。
[0003]限制性内切酶结合到它们的识别序列上，通常同时切割DNA的两条链，两个独立的水解反应同时进行，通常是由限制酶内存在的两个催化位点驱动的，每一个用于水解一条链。只能水解双链结构中的一条链，从而产生“切口”而不是切割的DNA分子，这一类酶称为缺刻内切酶。缺刻内切酶包括天然的缺刻内切酶，如：Nt.BstNBI、Nb.BtsI、Nb.BsrDI；也可以通过人工改造限制酶得到缺刻内切酶，如：Nt.BspQI、Nt.BbvCI、Nb.BsmI。缺刻内切酶产生的缺口可以作为各种进一步酶反应的起始点，如替换DNA合成、链位移放大(Walker et al.,1992)、核酸外切降解或小缺口的产生(Wang et al.,2000)，还可用于基因组制图。随着科学技术的发展，缺刻内切酶将发展出越来越多的用途。

技术实现思路

[0004]针对以上现有技术的不足，本专利技术发现了一种全新的核酸内切酶，成功克隆并建立了其表达纯化方法，进行了功能鉴定和应用探索，为DNA加工、基因工程和基因编辑等领域的研究与应用提供一种有效的候选工具酶。具体通过以下技术实现。
[0005]一种核酸内切酶，包括GajA蛋白和识别标签；
[0006]所述GajA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0007]所述识别标签为组氨酸标签、FLAG标签、HA标签、SBP标签、Avi标签、Nus标签、V5标
签中的任意一种；所述组氨酸标签的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0008]所述GajA蛋白的氨基端与所述识别标签连接。
[0009]虽然现有的技术文献中提到了Gabija细菌防御系统包含GajA蛋白和GajB蛋白两个组分，主要作用抵抗噬菌体队细菌的入侵。然而，GajA蛋白的功能还没有人进行相关研究。本专利技术的技术人员参考了现有的技术文献，预测GajA蛋白是ATP依赖的核酸内切酶。并经过大量的实验数据得以证实这种推论。GajA蛋白包含一个ATPase结构域和一个TOPRIM结构域，其在细菌防御系统中具有特异性的核酸切割加工能力，是Gabija细菌防御系统的核心组分。
[0010]本专利技术提供的核酸内切酶以GajA蛋白为主体，在GajA蛋白的氨基端还连接有识别标签。在GajA蛋白上接入这种识别标签有利于后续进行亲和层析纯化，得到不含RNA酶污染的应用级蛋白质。本专利技术所得到的GajA蛋白来自于Bacillus cereus VD045(蜡样芽孢杆菌VD045)，或者来自与所述GajA的蛋白质序列同源性高于20％并含有一个ATPase结构域和一个TOPRIM结构域的其他同源蛋白。本专利技术提供的核算内切酶的识别标签主要为组氨酸标签、FLAG标签、HA标签、SBP标签、Avi标签、Nus标签、V5标签中的任意一种。上述识别标签中，FLAG标签、HA标签、SBP标签、Avi标签、Nus标签、V5标签是目前行业内常用的氨基酸序列已知得标签。
[0011]本专利技术对GajA蛋白的功能的解析和发现，为生物学研究提供新的分子生物学工具酶乃至创造出新的核酸生物技术。
[0012]优选地，所述组氨酸标签的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，由6个组氨酸串联而成。
[0013]更优选地，所述核酸内切酶的氨基端与所述识别标签之间还连接有柔性肽段，所述柔性肽段由1
‑
10个氨基酸组成。在GajA蛋白和识别标签之间设置柔性肽段的作用是使所关联的标签充分展示，同时不影响目的蛋白的正确折叠。本专利技术所述的柔性肽段可采用现有富含甘氨酸或丝氨酸的串联组合，例如Gly
‑
Gly
‑
Ser
‑
Gly
‑
Gly
‑
Ser(GGSGGS，6个氨基酸)、Gly
‑
Gly
‑
Gly
‑
Gly
‑
Ser
‑
Gly
‑
Gly
‑
Gly
‑
Gly
‑
Ser(GGGGSGGGGS，10个氨基酸)等。这些串联组合中也可以包含蛋白酶切位点，例如Leu
‑
Val
‑
Pro
‑
Arg
‑
Gly
‑
Ser(LVPAGS)。
[0014]进一步优选地，所述柔性肽段为若干甘氨酸和若干丝氨酸的氨基酸串联组合，或含有蛋白酶切位点的氨基酸串联组合。
[0015]更进一步优选地，所述柔性肽段为SSGLVPAGSH。该柔性肽段即包含了序列为SSG的甘氨酸和丝氨酸的串联组合，也包含了蛋白酶切位点LVPAGS，还含有1个组氨酸(H)。
[0016]更优选地，所述核酸内切酶的缺刻位点的核苷酸识别序列为：
[0017]5’‑
TNNNSXRGGNNA
‑3’
；其中，S为G或C，R为A或G，N为A、G、C或T，X为缺刻位点。上述核苷酸识别序列即本专利技术的核酸内切酶的缺刻内切识别序列，序列中其中，S可以为鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)，R可以为腺嘌呤(A)或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸内切酶，其特征在于，包括GajA蛋白和识别标签；所述GajA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述识别标签为组氨酸标签、FLAG标签、HA标签、SBP标签、Avi标签、Nus标签、V5标签中的任意一种；所述组氨酸标签的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述GajA蛋白的氨基端与所述识别标签连接。2.根据权利要求1所述的核酸内切酶，其特征在于，所述组氨酸标签的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1或2所述的核酸内切酶，其特征在于，所述核酸内切酶的氨基端与所述识别标签之间还连接有柔性肽段，所述柔性肽段由1
‑
10个氨基酸组成。4.根据权利要求3所述的核酸内切酶，其特征在于，所述柔性肽段为若干甘氨酸和若干丝氨酸的氨基酸串联组合，或含有蛋白酶切位点的氨基酸串联组合。5.根据权利要求4所述的核酸内切酶，其特征在于，所述柔性肽段为SSGLVPAGSH。6.根据权利要求1或2所述的核酸内切酶，其特征在于，所述核酸内切酶的缺刻位点的核苷酸识别序列为5
’‑
TNNNSXRGGNNA
‑3’
；其中，S为G或C，R为A或G，N为A、G、C或T，X为缺刻位点。7.权利要求1或2所述的核酸内切酶的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤，S1、蛋白表达：S11、合成所述核酸内切酶的编码基因，将所述核酸内切酶的基因克隆到原核表达载体pET28a中，获得重组质粒；S12、将重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基平板上，置于37℃培养箱中静置培养过夜，挑取单克隆鉴定获得所述核酸内切酶表达菌种并于
‑
80℃环境中保种；S13、所述核酸内切酶表达菌种转接LB培养基中37℃过夜活化，按1％比例稀释后在37℃下放大培养；待OD
600
为0.6
‑
0.8时，加入终浓度为0.05
‑
0.4mM的IPTG诱导所述核酸内切酶表达，在10℃
‑
15℃的温度下诱导表达16
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱斌，成锐，
申请(专利权)人：武汉核圣生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：