本发明专利技术属于分子生物学领域技术领域，涉及一种番茄重金属镉抗性基因NRAMP3、其编码蛋白及其应用。NRAMP3基因编码序列如Seq1所示，NRAMP3基因与番茄响应镉胁迫相关，其在番茄根部和地上部均表达，并且受到镉的诱导表达。该基因的克隆有助于解析番茄对镉吸收和转运的分子机制，为提高作物安全生产提供新的思路，同时为培育镉抗性的番茄新品种提供基因资源和理论基础具有重要意义。和理论基础具有重要意义。和理论基础具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
番茄重金属镉抗性基因NRAMP3、相关蛋白及其应用
[0001]本专利技术属于分子生物学领域
，涉及一种番茄重金属镉抗性基因NRAMP3、其编码蛋白及其应用。
技术介绍
[0002]我国土壤总的超标率为16.1％，其中Cd污染位于无机污染物的首位，高达7％。镉是非必需元素，当植物体内积累一定量的镉时，会对植物产生严重的毒害作用。比如，重金属镉抑制植物的光合系统性能和呼吸作用(洪et al.,2008；滕et al.,2016)，引起植物细胞膜脂的过氧化且扰乱抗氧化系统(张et al.,2010)，扰乱植物对矿质营养的吸收和转运(张et al.,2010)等等，从而阻碍植物的生长发育，最终影响植物的产量、品质和安全。因此,阻控植物对重金属镉的积累和缓解其毒害作用已经成为农业生产中亟待解决的问题。
[0003]目前有两种解决方法：(1)使用各种物理、化学、生物的修复方式改变重金属镉在土壤中的存在形式，从而强化或者减弱植物吸收重金属的有效性，最终利用植物进行修复或者阻控其进入食物链的方法。(2)深入研究不同作物对镉的吸收转运的分子机理，用基因工程方式来降低植物对镉的吸收或者阻控镉向作物可食部分的积累。前者成本高且存在二次污染的风险，后者不管是对镉污染土壤的植物修复，还是对阻控镉进入食物链都有重要意义。
[0004]番茄作为人类日常生活中食用量最多的蔬菜之一，其品质的好坏直接影响人们的日常食品安全。研究表明番茄被认为是较容易吸收和积累镉的蔬菜之一(Chen et al.,2011b,Luo et al.,2018)。谭等研究发现，在2.0mg/kg Cd胁迫下,所有测试的不同品种番茄的可食部位镉的超标率为100％(谭et al.,2014)。而番茄中镉的过量积累可能会给人类的健康带来较大的威胁。因此，寻找一种阻控番茄镉吸收和转运的有效方法是当前亟待解决的技术问题。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是针对上述问题，提供一种番茄重金属镉抗性基因NRAMP3。
[0006]本专利技术的另一目的是提供一种番茄重金属镉抗性基因NRAMP3的编码蛋白质。
[0007]本专利技术的又一目的是提供一种含有番茄重金属镉抗性基因NRAMP3的重组质粒。
[0008]本专利技术的再一目的是提供一种含有番茄重金属镉抗性基因NRAMP3的转基因工程菌。
[0009]本专利技术的还有一目的是提供一种番茄重金属镉抗性基因NRAMP3在提高番茄对镉的抗性中的应用。
[0010]为达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：
[0011]一种番茄重金属镉抗性基因NRAMP3，基因核苷酸序列如序列表Seq 1所示。
[0012]在上述的番茄重金属镉抗性基因NRAMP3中，基因序列克隆来自合作903番茄品种的叶片。
[0013]一种番茄重金属镉抗性基因NRAMP3的编码蛋白质。
[0014]一种含有番茄重金属镉抗性基因NRAMP3的重组质粒。
[0015]在上述的重组质粒中，所述的重组质粒为NRAMP3
‑
pYS2质粒、p
‑
Easy::NRAMP3质粒或pBWAHS
‑
gfp::NRAMP3质粒。
[0016]一种含有番茄重金属镉抗性基因NRAMP3的转基因工程菌。
[0017]在上述的转基因工程菌中，所述的转基因工程菌为包含NRAMP3基因重组质粒的农杆菌菌株EHA105或酿酒酵母野生型菌株Sey6210。
[0018]一种番茄重金属镉抗性基因NRAMP3在提高植物对镉的抗性中的应用。
[0019]一种番茄重金属镉抗性基因NRAMP3在提高番茄对镉的抗性中的应用。
[0020]与现有的技术相比，本专利技术的优点在于：
[0021]本专利技术中，初步克隆并首次通过烟草和酵母异源体系对NRAMP家族类转运蛋白基因番茄NRAMP3基因(即NRAMP3)进行功能分析，显示其编码的蛋白具有镉转运活性，该转运蛋白在番茄响应镉胁迫过程中实现调控作用，影响番茄的镉吸收转运效率。
[0022]本专利技术丰富了番茄中重金属转运蛋白的研究，不仅为通过遗传改良培育低镉吸收的番茄新品种提供基因资源和理论基础，而且为在土壤污染条件下实现农产品安全绿色生产提供新的途径。
[0023]本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0024]图1是NRAMP3基因在镉胁迫下番茄根部和叶片中的表达变化。
[0025]图2是番茄NRAMP3蛋白在烟草叶片中的亚细胞定位。
[0026]图3是NRMAP3在酵母异源体系不同镉浓度胁迫下的生长表型。
具体实施方式
[0027]本专利技术提供了一种番茄重金属镉抗性基因NRAMP3、相关蛋白及其应用，具体步骤如下：
[0028]1.NRAMP3基因克隆及蛋白编码序列分析
[0029]番茄NRAMP3基因(即NRAMP3基因)，为NRAMP家族类转运蛋白基因，其克隆与序列结构分析，具体如下：
[0030]所述番茄是合作903番茄品种，取新鲜番茄叶片用于RNA的提取。总RNA的抽提采用Omega Plant RNA Kit(Omega，美国)试剂盒按照说明操作，用分光度计检测其RNA含量和质量。反转录生成第一链：取1μg RNA作模板，参考III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(诺唯赞，南京)试剂盒说明书进行配置，加入5ul 4
×
gDNA wiper Mix，补足至16μl，42℃,2min，立即在冰上放置。然后在上述反应液中加入4μl 5
×
HiScript III RT SuperMix，37℃,15min，85℃,5sec，即可以获得cDNA，然后在冰上放置备用。以cDNA作为PCR模板，通过常规PCR扩增方法，获得NRAMP3基因。其中上游引物：(5
’‑
CAGTGGTCTCAGATCATGCCTCTAAACGATGAAGA
‑3’
)，下游引物：(5
’‑
CAGTGGTCTCAAATTTCAATTATCTATGCTCGAGA
‑3’
)。
[0031]PCR反应条件(50μL体系)：无菌水20μl，Biorun Pfu PCR Mix 25μl，正向引物F
(100μM)2μL，反向引物(100μM)2μL，cDNA1μL；反应程序为：94℃，5min，1个循环；94℃，30sec，30个循环；50℃，45sec，30个循环；72℃，92sec，30个循环；72℃，10min，1个循环；16℃，30min，1个循环。PCR产物NRAMP3基因经纯化回收后，连接到p
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Easy Vector载体(全式金，北京)上得到p
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Easy::NRAMP本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种番茄重金属镉抗性基因NRAMP3，其特征在于，基因核苷酸序列如序列表Seq 1所示。2.根据权利要求1所述的番茄重金属镉抗性基因NRAMP3，其特征在于，基因序列克隆来自合作903番茄品种的叶片。3.根据权利要求1
‑
2任意一项所述的番茄重金属镉抗性基因NRAMP3的编码蛋白质。4.含有权利要求1
‑
2任意一项所述的番茄重金属镉抗性基因NRAMP3的重组质粒。5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒为NRAMP3
‑
pYS2质粒、p
‑
Easy::...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘俊丽，郭彬，裘高扬，刘琛，陈晓冬，李华，傅庆林，林义成，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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