一种基于铂纳米酶的级联信号放大检测方法及在卵巢癌生物标志物中的应用技术

本发明专利技术公开了一种基于铂纳米酶的级联信号放大检测方法，包括如下步骤：(1)构建磁性纳米探针；(2)构建铂纳米探针；(3)构建三明治免疫夹心结构；(4)诱导级联信号放大反应；(5)分析物的可视化定量检测。本发明专利技术一方面利用抗体对抗原的特异性识别原理，构建三明治免疫夹心结构，另一方面利用铂纳米酶诱导级联信号放大反应，实现了分析物识别信号到可视化墨水前进距离的转化，同时实现了分析物的超灵敏定量检测，并将此应用到卵巢癌生物标志物的检测。所述检测方法成本低廉、操作简单、反应时间短、灵敏度高和特异性强，为癌症生物标志物的即时诊断提供一种新的分析手段，并且可以推广到更多种生物标志物的检测。种生物标志物的检测。种生物标志物的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种基于铂纳米酶的级联信号放大检测方法及在卵巢癌生物标志物中的应用


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种基于铂纳米酶的级联信号放大检测方法及在卵巢癌生物标志物中的应用。

技术介绍

[0002]卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，其致死率排在各种妇科肿瘤的首位。由于卵巢癌的临床症状不明显，因此容易造成漏诊与误诊。临床统计表明，超过70％的卵巢癌患者在确诊时已到癌症晚期，并且扩散到了其他器官，错过了最佳的治疗时机。最近20年来，卵巢癌的5年存活率一直处在较低的水平，5年内的复发率高达80％，而且复发主要集中在治疗期的前3年内。如果卵巢癌能够被尽早诊断，癌细胞仅存在于卵巢内，患者的存活率可提高到75％
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95％，因此卵巢癌早期诊断非常重要。目前诊断卵巢癌主要使用两种检测方法。一种方法是阴道超声检查法(TUV)。这种成像方法可用于检查女性的生殖器官，包括子宫、卵巢、宫颈及阴道。虽然其应用较为普遍，但是这种方法并不能准确检测出该肿块是良性还是恶性。此外，该方法还依赖于经验丰富的临床技师对于检测结果进行解读。另一种常规检测方法是检测患者血液中的生物标志物CA125糖类抗原125和HE4人附睾蛋白4。其中CA125糖类抗原125的特异性及敏感度较低，容易出现假阴性或假阳性。与CA125糖类抗原125相比，HE4人附睾蛋白4的敏感度更高、特异性更强，尤其是在疾病初期无症状表现的阶段。疾病早期HE4人附睾蛋白4诊断的敏感度是82.7％，而CA125糖类抗原125却仅有45.9％。与CA125糖类抗原125仅20％的特异性相比，HE4人附睾蛋白4的特异性高达99％。HE4人附睾蛋白4与CA125糖类抗原125是相互补充的标志物，两者联合应用，敏感性可增加到92％，能将假阴性结果减少30％，大大增加了卵巢癌诊断的准确性。因此，两者联合使用，可避免单一应用的阴性结果造成疾病复发监测的漏诊。发展低成本、准确且灵敏度高的生物标志物定量检测方法对卵巢癌的早期诊断具有重要意义，并且能实时监控疾病的进程，从而辅助早期的治疗过程。

技术实现思路

[0003]为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于铂纳米酶的级联信号放大检测方法及在卵巢癌生物标志物中的应用。本专利技术利用抗体与抗原的特异性识别，构建三明治免疫夹心结构的磁性纳米探针
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分析物
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铂纳米探针，利用铂纳米探针的辣根过氧化物酶在过氧化氢条件下超快速催化多巴胺为聚多巴胺，并沉积在复合探针表面，以此交联大量铂纳米粒子，进而利用铂纳米粒子的过氧化氢酶活性进行可视化检测。
[0004]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术的一种基于铂纳米酶的级联信号放大检测方法，包括如下步骤：
[0005](1)构建磁性纳米探针：将氨基基团修饰的磁性二氧化硅纳米粒子用PBS磷酸缓冲盐溶液稀释，取戊二醛加入修饰好的磁性二氧化硅纳米粒子中活化，磁铁分离磁性二氧化
硅纳米粒子并添加PBS磷酸缓冲盐溶液；向其加入捕获抗体，孵育过夜，弃上清液，制得磁性纳米探针；
[0006]然后加入BSA牛血清白蛋白溶液封闭，磁铁吸附，用PBS磷酸缓冲盐溶液洗涤并重悬磁性纳米探针，避光存储备用；
[0007](2)构建铂纳米探针：将铂纳米粒子用Tris
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HCl三羟甲基氨基甲烷
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盐酸缓冲溶液稀释，向其加入检测抗体，孵育过夜，将混合溶液离心，制得铂纳米探针；
[0008]然后加入BSA牛血清白蛋白溶液，使终浓度为0.1～1％，继续反应；再离心，最后将已封闭的铂纳米探针分散于PBS磷酸缓冲盐溶液，避光存储备用；
[0009](3)构建三明治免疫夹心结构：将不同浓度的分析物加入步骤(1)制备的磁性纳米探针溶液中，孵育，磁铁吸附并用PBS磷酸缓冲盐溶液洗涤；之后加入步骤(2)中构建的铂纳米探针，孵育，形成三明治免疫夹心结构，磁铁吸附并用Tris
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HCl三羟甲基氨基甲烷
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盐酸缓冲溶液洗涤；
[0010](4)诱导级联信号放大反应：
[0011]将步骤(3)中构建的三明治免疫夹心结构的复合探针加入多巴胺溶液中，在室温条件下反应，铂纳米粒子超快速催化多巴胺形成聚多巴胺并沉积在BSA牛血清白蛋白封闭的磁性二氧化硅纳米粒子表面，磁铁分离并用PBS磷酸缓冲盐溶液进行重悬；然后加入巯基苯硼酸修饰的铂纳米粒子，室温下缓慢振荡反应，磁铁分离去除上清液，分散在水相中，从而制得含有大量铂纳米粒子的样品溶液；
[0012](5)分析物的可视化定量检测:
[0013]分别用移液枪将墨水、H2O2、步骤(4)中样品溶液分别加入多元体积柱芯片中相对应的通道中，滑动芯片，铂纳米粒子与H2O2反应并产生O2，从而推动墨水前进，记录墨水柱前进的距离，实现对分析物的可视化定量检测。
[0014]进一步地，本专利技术的一种基于铂纳米酶的级联信号放大检测方法，包括如下步骤：
[0015]在步骤(1)中，将1～5mg/ml为200～500nm氨基基团修饰的磁性二氧化硅纳米粒子用0.01M pH值为7.4的PBS磷酸缓冲盐溶液稀释，取20～100μL 25％戊二醛加入2ml修饰好的磁性二氧化硅纳米粒子中，在缓慢振荡的条件下活化0.5～2h，磁铁分离磁性二氧化硅纳米粒子并添加1ml的0.01M pH值为7.4的PBS磷酸缓冲盐溶液；向其加入10μL 0.01～1mg/ml捕获抗体，4℃下孵育过夜，磁铁吸附磁性二氧化硅纳米粒子并弃掉上清液，以除去未反应的捕获抗体，制得磁性纳米探针；然后加入BSA牛血清白蛋白溶液封闭0.5～2h，终浓度为0.1～1％，磁铁吸附，用0.01M pH值为7.4的PBS磷酸缓冲盐溶液洗涤并重悬磁性纳米探针，4℃避光存储备用；
[0016]在步骤(2)中，将0.5～3mg/ml的为10～50nm铂纳米粒子用0.01M pH值为7.4的Tris
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HCl三羟甲基氨基甲烷
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盐酸缓冲溶液稀释，向其加入10μL 0.01～1mg/ml检测抗体，4℃下孵育过夜，将混合溶液5000～10000r/min离心10min，制得铂纳米探针；然后加入BSA牛血清白蛋白溶液，使终浓度为0.1～1％，继续反应0.5～2h；再次以5000～10000r/min离心10min，最后将已封闭的铂纳米探针分散于0.01M pH值为7.4的PBS磷酸缓冲盐溶液，4℃避光存储备用；
[0017]在步骤(3)中，将不同浓度的分析物加入100μL步骤(1)制备的磁性纳米探针溶液中，在37℃下孵育0.5～5h，磁铁吸附并用0.01M pH值为7.4的PBS磷酸缓冲盐溶液洗涤；之
后加入100μL步骤(2)中构建的铂纳米探针，在37℃下孵育0.5～5h，形成三明治免疫夹心结构，磁铁吸附并用0.01M pH值为8.5的Tris
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HCl三羟甲基氨基甲烷
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盐酸缓冲溶液洗涤；
[001本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于铂纳米酶的级联信号放大检测方法，其特征在于包括如下步骤：(1)构建磁性纳米探针：将氨基基团修饰的磁性二氧化硅纳米粒子用PBS磷酸缓冲盐溶液稀释，取戊二醛加入修饰好的磁性二氧化硅纳米粒子中活化，磁铁分离磁性二氧化硅纳米粒子并添加PBS磷酸缓冲盐溶液；向其加入捕获抗体，孵育过夜，弃上清液，制得磁性纳米探针；然后加入BSA牛血清白蛋白溶液封闭，磁铁吸附，用PBS磷酸缓冲盐溶液洗涤并重悬磁性纳米探针，避光存储备用；(2)构建铂纳米探针：将铂纳米粒子用Tris
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HCl三羟甲基氨基甲烷
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盐酸缓冲溶液稀释，向其加入检测抗体，孵育过夜，将混合溶液离心，制得铂纳米探针；然后加入BSA牛血清白蛋白溶液，使终浓度为0.1～1％，继续反应；再离心，最后将已封闭的铂纳米探针分散于PBS磷酸缓冲盐溶液，避光存储备用；(3)构建三明治免疫夹心结构：将不同浓度的分析物加入步骤(1)制备的磁性纳米探针溶液中，孵育，磁铁吸附并用PBS磷酸缓冲盐溶液洗涤；之后加入步骤(2)中构建的铂纳米探针，孵育，形成三明治免疫夹心结构，磁铁吸附并用Tris
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HCl三羟甲基氨基甲烷
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盐酸缓冲溶液洗涤；(4)诱导级联信号放大反应：将步骤(3)中构建的三明治免疫夹心结构的复合探针加入多巴胺溶液中，在室温条件下反应，铂纳米粒子超快速催化多巴胺形成聚多巴胺并沉积在BSA牛血清白蛋白封闭的磁性二氧化硅纳米粒子表面，磁铁分离并用PBS磷酸缓冲盐溶液进行重悬；然后加入巯基苯硼酸修饰的铂纳米粒子，室温下缓慢振荡反应，磁铁分离去除上清液，分散在水相中，从而制得含有大量铂纳米粒子的样品溶液；(5)分析物的可视化定量检测:分别用移液枪将墨水、H2O2、步骤(4)中样品溶液分别加入多元体积柱芯片中相对应的通道中，滑动芯片，铂纳米粒子与H2O2反应并产生O2，从而推动墨水前进，记录墨水柱前进的距离，实现对分析物的可视化定量检测。2.根据权利要求1所述的基于铂纳米酶的级联信号放大检测方法，其特征在于：在步骤(1)中，将1～5mg/ml为200～500nm氨基基团修饰的磁性二氧化硅纳米粒子用0.01M pH值为7.4的PBS磷酸缓冲盐溶液稀释，取20～100μL 25％戊二醛加入2ml修饰好的磁性二氧化硅纳米粒子中，在缓慢振荡的条件下活化0.5～2h，磁铁分离磁性二氧化硅纳米粒子并添加1ml的0.01M pH值为7.4的PBS磷酸缓冲盐溶液；向其加入10μL 0.01～1mg/ml捕获抗体，4℃下孵育过夜，磁铁吸附磁性二氧化硅纳米粒子并弃掉上清液，以除去未反应的捕获抗体，制得磁性纳米探针；然后加入BSA牛血清白蛋白溶液封闭0.5～2h，终浓度为0.1～1％，磁铁吸附，用0.01M pH值为7.4的PBS磷酸缓冲盐溶液洗涤并重悬磁性纳米探针，4℃避光存储备用；在步骤(2)中，将0.5～3mg/ml为10～50nm铂纳米粒子用0.01M pH值为7.4的Tris
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HCl三羟甲基氨基甲烷
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盐酸缓冲溶液稀释，向其加入10μL 0.01～1mg/ml检测抗体，4℃下孵育过夜，将混合溶液5000～10000r/min离心10min，制得铂纳米探针；然后加入BSA牛血清白蛋白溶液，使终浓度为0.1～1％，继续反应0.5～2h；再次以500...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉珍，韩圆月，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：