高通量实时荧光检测分析系统FLIPR在植物钙信号检测中的应用技术方案

本发明专利技术提供了高通量实时荧光检测分析系统FLIPR在植物钙信号检测中的应用，将FLIPR系统成功地应用到了植物钙信号的检测中，增加了FLIPR系统在植物钙信号检测中的用途。同时，本发明专利技术提供的基于FLIPR检测植物钙信号的方法，对外源钙信号CaCl2溶液刺激植物所产生的钙信号变化进行检测，为实现植物钙离子高通量实时荧光检测奠定了基础。荧光检测奠定了基础。荧光检测奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
高通量实时荧光检测分析系统FLIPR在植物钙信号检测中的应用


[0001]本专利技术属于植物细胞检测
，具体涉及高通量实时荧光检测分析系统FLIPR在植物钙信号检测中的应用。

技术介绍

[0002]高通量实时荧光检测分析系统FLIPRTETRA是MolecularDevices公司最新推出的高通量CCD成像读板机，是一台将加液系统和检测系统完美整合的仪器，也是目前GPCR定量检测仪器中唯一能将高通量和高质量完美结合的仪器。高通量实时荧光检测分析系统FLIPR TETRA用于检测GPCR受体和离子通道活动，使得在药物筛选初期可靠、灵活、高通量筛选先导化合物成为可能。
[0003]目前国内外对于FLIPR的应用仅限于心肌细胞缺氧损伤、采用FLIPR Calcium4试剂盒检测药物对胞浆内钙离子浓度变化的影响、采用FLIPR钙分析法检测化合物对内皮素
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1(endothelin
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1，ET
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1)激活高表达内皮素受体的CHO细胞内钙升高的抑制作用、离子通道结构和功能的筛选等医学和动物领域，植物领域鲜有报道。
[0004]钙作为植物体内第二信使广泛参与了植物响应的各种非生物和生物胁迫的信号传导，植物细胞利用胞内的钙离子作为媒介可以响应外界的环境变化，植物细胞感知胞外环境变化后，会编码特异的“钙指纹”，被胞内钙离子感受器识别后，通过“解码”过程启动下游各种生理反应来应对环境变化。多年来，钙信号及其对植物的发育及其生理生化过程的相关研究一直为本领域中的研究重点，因而对于本领域来讲，研发一种可检测植物钙信号的方法对于推进植物钙信号的相关研究是非常必要的。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供了高通量实时荧光检测分析系统FLIPR在植物钙信号检测中的应用。本专利技术成功地将FLIPR系统应用到了植物钙信号的检测中，为实现植物钙离子高通量实时荧光检测奠定了基础。
[0006]本专利技术提供了高通量实时荧光检测分析系统FLIPR在植物钙信号检测中的应用，所述植物包括报春花属植物、缬草属植物、烟草属植物和拟南芥属植物。
[0007]优选的，所述报春花属植物包括报春花，所述缬草属植物包括缬草，所述烟草属植物包括烟草，所述拟南芥属植物包括拟南芥。
[0008]本专利技术还提供了一种基于FLIPR检测植物钙信号的样本前处理方法，包括如下步骤：
[0009]将植物原生质体与钙染料混合，得到第一混合物；
[0010]将所述第一混合物与钙信号螯合剂和外源钙信号刺激溶液混合，将得到的第二混合物孵育和第一离心，得到待上机样本。
[0011]优选的，所述植物原生质体与钙染料的体积比为(0.1～10)：(0.5～5)。
[0012]优选的，所述钙信号螯合剂包括EGTA溶液、乙二胺或2，2'
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联吡啶；所述外源钙信号刺激溶液包括CaCl2溶液、CaCO3或Ca2NO3。
[0013]优选的，当所述钙信号螯合剂为EGTA溶液，所述外源钙信号刺激溶液为CaCl2溶液时，所述EGTA溶液和CaCl2溶液体积总和与第一混合物的体积比为(0.1～6)：(1～15)。
[0014]优选的，所述EGTA溶液的摩尔浓度为5～200μM；所述CaCl2溶液的摩尔浓度为220～450mM。
[0015]优选的，所述植物原生质体的提取方法包括如下步骤：
[0016]将植物组织与裂解液混合，裂解5～7h，过滤和第二离心，得到植物组织裂解物；
[0017]将所述植物组织裂解物与质量浓度为5～20％的CPW洗液混合，第三离心，得到原生质体洗液混合物；
[0018]将所述原生质体洗液混合物置于质量浓度为0.5～50％的蔗糖溶液表面，第四离心，得到植物原生质体；
[0019]所述植物组织的质量与裂解液的体积比为0.1～10g：1.0～30mL。
[0020]优选的，所述裂解液包括如下组分：
[0021]1wt.％纤维素酶、1wt.％果胶酶、0.7mol/L甘露醇、0.7mmol/L KH2PO4和10mmol/L CaCl2·
2H2O，所述裂解液的pH值为6.8～7.0。
[0022]本专利技术还提供了一种基于FLIPR检测植物钙信号的检测方法，将上述技术方案所述的样本前处理方法得到的待上机样本上机，采用高通量实时荧光检测分析系统FLIPR对所述待上机样本进行钙信号检测。
[0023]有益效果：
[0024]本专利技术提供了高通量实时荧光检测分析系统FLIPR在植物钙信号检测中的应用，将FLIPR系统成功地应用到了植物钙信号的检测中，增加了FLIPR系统在植物钙信号检测中的用途。
[0025]其次，本专利技术提供了一种基于FLIPR检测植物钙信号的样本前处理方法，基于FLIPR系统，对外源钙信号CaCl2溶液刺激植物所产生的钙信号变化进行检测，为实现植物钙离子高通量实时荧光检测奠定了基础。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0027]图1为巴蜀报春叶片的原生质体图；
[0028]图2～5为不同浓度CaCl2溶液对巴蜀报春叶片原生质体钙信号的影响；
[0029]图6～7为不同浓度ETGA溶液对巴蜀报春叶片原生质体内部钙信号的螯合作用；
[0030]图8～9为EGTA溶液和CaCl2溶液复合反应对巴蜀报春叶片原生质体钙信号的影响；
[0031]图10为巴蜀报春萼片的原生质体图；
[0032]图11～12为不同浓度CaCl2溶液对巴蜀报春萼片原生质体钙信号的影响；
[0033]图13～14为不同浓度ETGA溶液对巴蜀报春萼片原生质体内部钙信号的螯合作用；
[0034]图15～16为EGTA溶液和CaCl2溶液复合反应对巴蜀报春萼片原生质体钙信号的影
响；
[0035]图17为巴蜀报春花瓣的原生质体图；
[0036]图18～19为不同浓度CaCl2溶液对巴蜀报春花瓣原生质体钙信号的影响；
[0037]图20～21为不同浓度ETGA溶液对巴蜀报春花瓣原生质体内部钙信号的螯合作用；
[0038]图22～23为EGTA溶液和CaCl2溶液复合反应对巴蜀报春花瓣原生质体钙信号的影响；
[0039]图24为缬草叶片的原生质体图；
[0040]图25～26为不同浓度CaCl2溶液对缬草叶片原生质体钙信号的影响；
[0041]图27～28为不同浓度ETGA溶液对缬草叶片原生质体内部钙信号的螯合作用；
[0042]图29～30为EGTA溶液和CaCl2溶液复合反应对缬草叶片原生质体钙信号的影响。
具体实施方式
[0043]本专利技术提供了高通量实时荧光检测分析系统FLIPR在植物钙信号检测中的应用，所述植物包括报春花属植物、缬草属植物、烟草本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.高通量实时荧光检测分析系统FLIPR在植物钙信号检测中的应用，其特征在于，所述植物包括报春花属植物、缬草属植物、烟草属植物和拟南芥属植物。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述报春花属植物包括报春花，所述缬草属植物包括缬草，所述烟草属植物包括烟草，所述拟南芥属植物包括拟南芥。3.一种基于FLIPR检测植物钙信号的样本前处理方法，其特征在于，包括如下步骤：将植物原生质体与钙染料混合，得到第一混合物；将所述第一混合物与钙信号螯合剂和外源钙信号刺激溶液混合，将得到的第二混合物孵育和第一离心，得到待上机样本。4.根据权利要求3所述的样本前处理方法，其特征在于，所述植物原生质体与钙染料的体积比为(0.1～10)：(0.5～5)。5.根据权利要求3所述的样本前处理方法，其特征在于，所述钙信号螯合剂包括EGTA溶液、乙二胺或2，2'
‑
联吡啶；所述外源钙信号刺激溶液包括CaCl2溶液、CaCO3溶液或Ca2NO3溶液。6.根据权利要求5所述的样本前处理方法，其特征在于，当所述钙信号螯合剂为EGTA溶液，所述外源钙信号刺激溶液为CaCl2溶液时，所述EGTA溶液和CaCl2溶液体积总和与第一混合物的体积比为(0.1～6)：(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘杰，乙引，龚记熠，唐明，张习敏，李欲轲，张宇斌，
申请(专利权)人：贵州师范大学，
类型：发明
国别省市：