褪黑素核受体RORα在提高冷冻精液品质中的用途制造技术

本发明专利技术提供了褪黑素核受体RORα在提高精液品质中的用途。通过提高褪黑素核受体RORα的表达量，再加入褪黑素后可以进一步提高冷冻精液解冻后的品质。本发明专利技术还提供了一种提高牛冷冻精液品质的方法，该方法将冷冻精液解冻处理后添加褪黑素处理同时添加褪黑素核受体RORα激动剂进行孵育。通过检测精子活率、顶体完整性。结果显示，褪黑素通过核受体基因RORα提高了精液品质。本发明专利技术方法具有良好的应用前景。景。

【技术实现步骤摘要】
褪黑素核受体ROR
α
在提高冷冻精液品质中的用途


[0001]本专利技术涉及繁殖领域。具体涉及冷冻精液品质的提升。

技术介绍

[0002]随着生物技术的快速发展，配子与胚胎冷冻保存正逐步成为替代活畜保种的最有效方式。精液冷冻保存是将精液经过特殊处理，添加保护剂后，保存在超低温下（通常采用液氮
‑
196℃保存），以达到长期保存的目的。其最大优点是可长期保存，且使用不受时间、地域以及雄性动物寿命的限制。同时，可极大提高种公牛的利用效率。
[0003]精液在冷冻过程中的冰晶损伤、抗冻保护剂毒性及氧化应激的发生是造成解冻后精液品质不高，输精后受胎率低的主要原因。这很大程度与精子冷冻过程中产生大量ROS相关。多项研究表明，冷冻精液中添加褪黑素有助于精子抗冻保护。添加褪黑素后的冷冻精液中，活精子数、活力以及动力学相关参数显著提高，精子膜系统如顶体膜、质膜的完整性明显提升。然而，当褪黑素添加到一定量后，精子的质量无法进一步提升。
[0004]
技术实现思路

[0005]本专利技术的第一个目的在于提供褪黑素核受体RORα的用途。
[0006]本专利技术的第二个目的在于提供一种提高冷冻精液品质的方法。
[0007]本专利技术研究发现，由于采用褪黑素来提升冷冻精液品质时会存在瓶颈，想要显著提升冷冻精液的品质已然十分困难。当提高褪黑素核受体RORα的表达量时，精液的品质可以得到进一步显著提升。据此，本专利技术首先提供褪黑素核受体RORα在提升精液品质中的用途。/>[0008]上述用途中，所述提高精液品质包括提高精子活力以及提高精子顶体完整性。
[0009]本专利技术进一步提供一种提高精液品质的方法，其通过提高褪黑素核受体蛋白RORα的表达量并向精液中添加褪黑素来提高精液品质。
[0010]进一步地，所述精液为冷冻精液，包括但不限于牛、马或其他牲畜或人的精液。在实践中，奶牛性控冻精是繁殖领域运用最多的冷冻精液。
[0011]进一步地，所述提高精液品质的方法包括步骤：将冷冻精液解冻回收精子后加入PBS和精液稀释液重悬，再加入褪黑素核受体蛋白RORα激动剂和褪黑素并孵育。
[0012]优选地，所述褪黑素核受体蛋白RORα激动剂加入至终浓度0.001~0.1mM。更优选地，所述褪黑素核受体蛋白RORα激动剂加入至终浓度0.01mM。褪黑素核受体蛋白RORα激动剂的添加浓度以实现褪黑素核受体蛋白RORα表达提升为有效量。在实践中可以根据本专利技术实施例提供的方法来确定激动剂的有效添加量。
[0013]优选地，所述褪黑素加入至终浓度0.001~0.1mM。更优选地，所述褪黑素加入至终浓度0.01mM。褪黑素的添加浓度以实现精液品质提升为有效量。在实践中可以根据本专利技术实施例中提供的方法来确定褪黑素的有效添加量。
[0014]冷冻精液的解冻和回收可以采用现有的常规手段，优选地，可以采用本专利技术实施例中的方法，用镊子从液氮中迅速取出性控冻精，置于37℃恒温水浴锅中晃动解冻30s，解冻后，用吸水纸擦拭细管，收集精液于1.5mL离心管中，室温378
ꢀ×
g离心5min，弃上清，再次加入1mL 37℃ PBS 重悬精子，室温378
ꢀ×
g离心 5min，弃上清，重复两次。
[0015]回收后的精子可以采用常规方法来重悬，例如对于性控冻精，采用1.5mL的离心管离心回收则可以添加170μL PBS和170μL精液稀释液来进行重悬。
[0016]本专利技术中的褪黑素核受体蛋白RORα表达量的提升可以通过例如褪黑素核受体蛋白RORα激动剂的方式来提升，或者通过过表达的方式来提升褪黑素核受体蛋白RORα的表达量，或者通过其他调控途径来提升褪黑素核受体蛋白RORα的表达量。但是对于冷冻精液的处理而言，添加激动剂是一个简便有效的途径。
[0017]本专利技术还提供褪黑素核受体蛋白RORα激动剂的用途，也即通过黑素核受体蛋白RORα激动剂来提升褪黑素核受体蛋白RORα的表达量，进而提升精液品质。也即可以通过黑素核受体蛋白RORα激动剂来提升精液品质。即提供褪黑素核受体蛋白RORα激动剂在提升精液品质中的用途。
[0018]进一步，本专利技术还提供褪黑素和褪黑素核受体蛋白RORα激动剂在制备提升冷冻精液品质制剂中的用途。
[0019]进一步本专利技术还提供一种制剂，其包括褪黑素和褪黑素核受体蛋白RORα激动剂。用于冷冻精液品质的提升。此制剂中含有有效量的褪黑素和有效量的褪黑素核受体蛋白RORα激动剂即可。优选地，两者按照摩尔比之比例如为1~10:1~10，例如为1:0.5~5，例如为1:1。在本专利技术的一个实施例中，其添加量为终浓度0.01mM褪黑素和0.01mM核受体蛋白RORα激动剂。在具体应用时，可以按照本专利技术实施例中的方法来测试最终添加量。对于制剂而言，可以将制剂浓度设置成例如褪黑素3.4mM和褪黑素核受体蛋白RORα激动剂3.4mM。
[0020]专利技术提通过提高褪黑素核受体RORα的表达量，再加入褪黑素后可以进一步提高冷冻精液解冻后的品质。本专利技术方法将冷冻精液解冻处理后添加褪黑素处理同时添加褪黑素核受体RORα激动剂进行孵育，通过检测精子活率、顶体完整性。结果显示，褪黑素通过核受体RORα提高了精液品质。本专利技术方法及制剂具有良好的应用前景。
附图说明
[0021]图1为褪黑素核受体基因RORα在牛冷冻精子中的表达；图2为牛冷冻精子褪黑素添加前后以及与激动剂和抑制剂共孵育后褪黑素核受体基因RORα的表达情况。
具体实施方式
[0022]以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制，在不背离本专利技术的精神和实质的情况下，对本专利技术技术方案的修改或润湿，均属于本专利技术的范围。
[0023]实施例11.1材料与方法1.1.1试验设计取3头奶牛的冷冻精液各8支，分为对照组、褪黑素、褪黑素+激动剂、褪黑素+抑制
剂组共孵育2小时后，进行精液品质检测以及RNA和蛋白提取，分别进行荧光定量PCR和Western blot检测，各组试验重复3次。
[0024]1.1.2主要仪器设备名称
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厂家37℃恒温水浴锅
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上海科佐精子（微生物）动静态分析系统
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清华同方荧光显微镜
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尼康枪头
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Axygen离心管
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Axygen1mL注射器
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金塔酶标仪
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.褪黑素核受体RORα在提高精液品质中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高精液品质包括提高精子活力。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高精液品质包括提高精子顶体完整性。4.一种提高精液品质的方法，其通过提高褪黑素核受体蛋白RORα的表达量并向精液中添加褪黑素来提高精液品质。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述精液为冷冻精液。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，将冷冻精液解冻回收精子后加入PBS和精液稀...

【专利技术属性】
技术研发人员：许晓玲，刘彦，白佳桦，贾春云，秦玉圣，肖霖力，孙立晨，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：