基于RNAi干扰核盘菌OAH基因的重组载体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开一种基于RNAi干扰核盘菌OAH基因的重组载体及其构建方法与应用，具体涉及到通过RNAi干扰技术干扰核盘菌中OAH基因的表达、克隆、草酸的合成与技术应用。本发明专利技术从核盘菌中分离克隆得到核盘菌关键致病蛋白OAH核苷酸序列，将其作为干涉片段，靶向沉默核盘菌OAH基因表达，该序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术对RNAi干扰核盘菌OAH基因的功能进行了验证。通过基因工程技术在沉默核盘菌OAH基因表达，影响草酸合成积累，使转基因油菜叶片及茎秆接种菌核病后病斑面积减少，提高转基因油菜对核盘菌的抗性，对增强甘蓝型油菜对菌核病抗性具有重要的应用前景。重要的应用前景。重要的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
基于RNAi干扰核盘菌OAH基因的重组载体及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，尤其涉及一种基于RNAi干扰核盘菌OAH基因的重组载体及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是制约油菜生产的最主要病害。核盘菌治病范围十分广泛，可寄生75个科278个科属400多种植物，每年在世界范围内造成巨大的经济损失(Boland G.，Hall R.Index of plant hosts of Sclerotinia sclerotiorum[J].Can J Plant Pathol，1994,16:93
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108)。核盘菌引起的菌核病不仅会导致油菜减产，还会使油菜籽的品质下降(张晓娟，张羽,胡胜武.油菜菌核病抗性机理及抗病遗传育种研究进展,分子植物育种，2016,14(3):704
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711)。目前防治核盘菌的方法主要依靠化学防治法和抗病品种选育，但是化学防治方法存在较多的不足，比如防治效果不高，花期喷药困难，容易造成农药残留，易造成环境污染，时间一长，容易造成核盘菌产生耐药性，从而导致杀菌剂防治效果下降(秦虎强,陈芳颖,付鼎程.油菜菌核病菌对10种杀菌剂的敏感性及不同药剂田间防效[J].西北农林科技大学学报自然科学版,2011,39(7):117
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122)。由此，常规防治核盘菌的方法不足以满足油菜产量需求，利用分子育种技术培育抗核盘菌品种油菜成为提高油菜产量的重要策略。
>[0003]核盘菌是一种典型的死体营养型植物病原真菌(Hegedus D.D,Rimmer S.R.Sclerotinia sclerotiorum:When“to be or not to be”a pathogen[J].Ferns Microbiology Letters,2005,251(2):177
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184)。核盘菌致病机理复杂，目前的研究主要认为核盘菌通过分泌植物细胞壁降解酶(Plant cell wall degrading enzymes,PCWDEs)降解寄主细胞壁，分泌草酸(Oxalic acid,OA)来协助其侵染植物,另外一些效应因子(Effector)也参与核盘菌与寄主之间的互作。草酰乙酸水解酶(OAH)是产生草酸的关键性酶(Jarosz Wil kolaz ka A.,Gadd GM.Oxalate production by wood
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rotting fungi growing in toxic metal
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amended medium[J].Chemosphere，2003,52(3)：541
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547)。在草酸合成的最后一步中，该酶能够将草酰乙酸水解，直接形成草酸(Dutton MV,Evans C.S.Oxalate production by fungi:Its role in pathogenicity and ecology in the soil environment[J].Canadian Journal of Microbiology,1996,42(9)：881
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895)，是真菌中特有的酶。在真菌的草酸代谢研究中，草酰乙酸水解酶也是研究的必要性酶。
[0004]Godoy等利用紫外诱变核盘菌子囊孢子，获得了草酸缺乏突变体，该突变体致病力降低，证实草酸在核盘菌侵染中起到重要作用(Godoy G.,Steadman J.R.,Dickman M.B,Dam R.Use of mutants to demonstrate the role of oxalic acid in pathogenicity of Sclerotinia sclerotiorum on Phaseolus vulgaris[J].Physiological and Molecular Plant Pathology,1990,37(3):179
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191)。Xu等使用两种独立的诱变技术产生了核盘菌的草酸缺失突变株，该突变株可以积累富马酸，但对环境的酸化能力降低，但其毒
extracellular vesicles to fungal pathogen to silence virulence genes[J].Science,2018,360(6393):1126
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1129)。最近，有研究人员利用HIGS技术在烟草中表达核盘菌Sschs的RNAi结构，发现转基因T1代烟草的菌核病抗性显著增强(Andradecm,Tinoco M.L.P.,Riethaf,Maia Fco,FJL.Host
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induced gene silencing in the necrotrophic fungal pathogen Sclerotinia sclerotiorum[J].Plant Pathology,2016,65(4):626
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632.)。有研究者生产了表达针对MAP激酶基因(PsFUZ7)的RNAi构建体的转基因小麦品系，并证明它们对锈菌基因Pst具有明显的抗性(Zhu X.,Qi T.,Yang Q.,et al.Host
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Induced Gene Silencing of the MAPKK Gene PsFUZ7 Confers Stable Resistance to Wheat Stripe Rust[J].Plant Physiol,2017,175(4):1853
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1863.)2018年，在转基因小麦中又产生了针对蛋白激酶A(PsCPK1)催化亚基基因的siRNA，并在第四代小麦中观察到对真菌Pst的抗性，并表明cAMP信号通路基因被下调(Qi T.,Zhu X.,Tan C.,et al.Host
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induced gene silencing of animportant pathogenicity factor PsCPK1 in Puccinia striiformis f.sp.tritici enhances resistance of wheat to stripe rust[J].Plant Biotechnol J,2018,16(3):797
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807.)。
[0006]综上所述，RNAi干扰核盘菌致病关键基因OAH能够干扰核盘菌草酸的积累，从而降低核盘菌对甘蓝型油菜的毒害。但目前对利用RNAi干扰核盘菌致病关键基因OAH的研究尚不深入，其他真菌的OAH基因功能报道很少，对其他作物的作用尚不清楚。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本申请提供一种基于RNAi干扰核盘菌OAH基因的重组载体及其构建方法与应用，提高甘蓝型油菜对菌核病抗性。
[0008]为达到上述技术目的，本申请采用以下技术方案：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组载体pCAMBIA1301
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D35s
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SsOAH
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NOS，其特征在于所述重组载体包含SEQ ID NO：1所示的核盘菌OAH基因的干扰核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，其构建过程如下：在载体pCAMBIA1301的KpnI与SpeI酶切位点处进行双酶切，将核盘菌的致病基因OAH与Link片段连接，获得的正向干涉片段和反向干涉片段与回收的pCAMBIA1301线性载体质粒进行连接，即得所述重组载体。3.如权利要求1所述的重组载体在抗油菜菌核病中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组载体用于构建SS.OAH.RNAi的转基因株系。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜雪竹，杨一丹，董祥，陈飞志，何督，张岩，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：