一种促进玉米生长解磷真菌与其筛选、鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种促进玉米生长解磷真菌与其筛选、鉴定方法，具体涉及微生物技术领域，该解磷真菌命名为N062，其具体分类命名为AspergillusnigerN062，其微生物保藏编号为：CCTCCNO：M2022656，菌种保藏地址为：中国典型培养物保藏中心，该解磷真菌的序列如SEQ.No1所示。本发明专利技术提供了一种促进玉米生长解磷真菌的分离筛选方法，得到既解有机磷又解无机磷的单菌落，本发明专利技术还提供了一种促进玉米生长解磷真菌的DNA提取与鉴定方法。该解磷真菌具有解磷、耐盐碱能力、并且对玉米具有良好的促生效果，在改良盐碱土壤、制作解磷促生菌肥方面具有良好前景，通过对玉米促生实验分析实验组和对照组的根重、茎叶重、SPAD值、氮含量具有显著差异，其中第二片叶SPAD值、氮含量，第三片叶氮含量的差异得出。含量的差异得出。含量的差异得出。

【技术实现步骤摘要】
一种促进玉米生长解磷真菌与其筛选、鉴定方法


[0001]本专利技术属于微生物
，具体为一种促进玉米生长解磷真菌与其筛选、鉴定方法。

技术介绍

[0002]磷是玉米作物等植物生命活动中非常重要的元素，有大量报道指出微生物生命活动过程中能够改变土壤养分含量，增加土壤中有机质、氮、有效磷、有效钾的含量，提高养分利用率。但目前我国土壤中磷很多是植物无法直接利用的难溶磷盐，因此虽然土壤中总磷含量较丰富，但有效磷含比较低。过去农业生产大多通过施用有效磷肥增加土壤中有效磷含量，然而盐碱胁迫能加速有效磷与铁离子、钙离子等的结合进而转化为难溶磷酸盐，造成土壤中磷库增加但有效磷含量依然很低的现象。
[0003]解磷微生物在土壤有效磷的转化中起重要作用，耐盐碱解磷微生物能够快速高效在盐碱胁迫下将难溶磷转化为植物可吸收的有效磷，在土壤总磷含量不变的情况下增加有效磷含量。因此，找到一种能够有效解磷微生物对推广耐盐碱解磷微生物菌肥具有重要意义。而寻找耐盐碱解磷微生物的难点在于微生物的筛选、鉴定与其性能的确定。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供一种促进玉米生长解磷真菌与其筛选、鉴定方法，解决耐盐碱解磷微生物菌种、筛选、鉴定等问题。
[0005]为实现上述目的：本专利技术提供了如下技术方案：
[0006]一种促进玉米生长解磷真菌，所述解磷真菌命名为N062，其具体分类命名为 Aspergillus niger N062，其微生物保藏编号为：CCTCC NO：M2022656，菌种保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心。
[0007]作为优选，一种促进玉米生长解磷真菌，所述解磷真菌的序列如SEQ.No 1所示；
[0008]本专利技术还提供了一种促进玉米生长解磷真菌的分离筛选方法，包括如下步骤：
[0009]S01:采集玉米根际土壤样品1500g，用无菌袋封装好带回实验室；
[0010]S02:在超净台内选取10g附着在玉米根系上的土壤，加无菌水至100ml，放入28℃ /180r摇床1h，使土壤中菌落均匀分散水中，静置0.5h使土壤颗粒沉淀；
[0011]S03:吸取上清水稀释至10
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2、10
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3、10
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4、10
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5、10
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6倍，分别取200ul涂布于PDA 培养基，培养48h后挑取单菌落进行3
‑
5次纯化，
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80℃保种备用；
[0012]S04:将纯化后的单菌落于无机磷平板培养，28℃条件下静置培养48h，选取产生透明光圈的单菌落；
[0013]S05:再将产生透明圈的单菌落于有机磷平板培养，同样选取有透明光圈的单菌落,得到既解有机磷又解无机磷的单菌落N062，
‑
80℃保种备用。
[0014]本专利技术还提供了一种促进玉米生长解磷真菌的DNA提取与鉴定方法，包括如下步骤：
[0015]S01:刮取菌丝覆盖2ml离心管底部，加入CTAB700ul和研磨珠在研磨仪中研磨，6次，60s/次；
[0016]S02:研磨均匀后放入65℃水浴1h，每十分钟震荡10s，使CTAB与菌丝充分混匀；
[0017]S03:取出离心管至常温，放置2分钟后加入600μl氯仿(三氯甲烷)，充分震荡，使CTAB与氯仿充分接触，室温静置2分钟；
[0018]S04:12000rpm离心15分钟，小心吸取上清液500μl至新的1.5ml离心管中，加入500μl异丙醇，充分混匀可见DNA絮状物，
‑
20℃放置2小时左右；
[0019]S05:将
‑
20C保存的DNA取出，12000rpm离心15分钟，弃去上清，DNA沉淀在离心管底部；
[0020]S06：加入500μl70％乙醇洗涤DNA沉淀，7500rpm离心5分钟，弃上清，将乙醇洗涤过的DNA室温晾干；
[0021]S07:晾干后的DNA用30μlddH2O溶解，
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20℃保存待用；
[0022]S08:解磷真菌菌株DNA分子鉴定。
[0023]作为优选，步骤S08所述的解磷真菌菌株DNA分子鉴定的通用引物为引物ITS1和引物ITS4；
[0024]作为优选，步骤S08所述的解磷真菌菌株DNA分子鉴定的PCR反应体系为2
×
PCRMasterMix：10ul；所述引物ITS1：1ul；所述引物ITS4：1ul；DNA模板：1ul；ddH2O：7ul；
[0025]作为优选，步骤S08所述的解磷真菌菌株DNA分子鉴定的PCR反应程序为95℃预变性10min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃∞；
[0026]作为优选，本专利技术提供了一种促进玉米生长解磷真菌，所述解磷真菌具有耐盐性能，在30g/L盐胁迫下可正常生长，盐浓度增加至70g/L时，生长开始受到抑制，90g/L时，生长受到明显抑制，生长缓慢；
[0027]作为优选，本专利技术提供了一种促进玉米生长解磷真菌，所述解磷真菌具有耐酸碱性能在pH＝3
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12的培养基上生长良好；
[0028]作为优选，本专利技术提供了一种促进玉米生长解磷真菌，所述解磷真菌能够分泌嗜铁素，改善植物的铁营养状况，可通过CAS培养基培养检测方法验证；
[0029]作为优选，本专利技术提供了一种促进玉米生长解磷真菌，所述解磷真菌具有解磷、耐盐碱能力、并且对玉米具有良好的促生效果，该菌种在改良盐碱土壤、制作解磷促生菌肥方面具有良好前景，通过对玉米促生实验分析实验组和对照组的根重、茎叶重、SPAD值、氮含量具有显著差异，其中第二片叶SPAD值、氮含量，第三片叶氮含量的差异得出。
[0030]本专利技术有效的解决了解磷真菌筛选、鉴定、性能测试等问题，为耐盐碱解磷微生物菌肥的制作所需菌种奠定基础。
附图说明
[0031]图1为N062平板培养生长图；
[0032]图2为N062的耐盐性能测试图；
[0033]图3为N062的耐酸碱性能测试图；
[0034]图4为N062在盐胁迫下解磷效果图；
[0035]图5为N062在碱胁迫下解磷效果图；
[0036]图6为N062在盐碱互作下解无机磷效果图；
[0037]图7为N062在盐碱互作下解有机磷效果图；
[0038]图8为N062在CAS培养基上显色反应图；
[0039]图9为N062对青农11表型促生效果图；
[0040]图10为N062对青农11叶片SPAD值和含氮量的促进效果分析图；
[0041]图11为N062对郑单958表型促生效果图；
[0042]图12为N062对郑单958叶片SPAD值和含氮量的促进效果分析具体实施方式图；
具体实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进玉米生长解磷真菌，其特征在于，解磷真菌命名为N062，其具体分类命名为Aspergillus niger N062，其微生物保藏编号为：CCTCC NO：M2022656，菌种保藏地址为：中国典型培养物保藏中心。2.根据权利要求1所述的一种促进玉米生长解磷真菌，其特征在于，所述解磷真菌的序列如SEQ.No 1所示。3.一种促进玉米生长解磷真菌的分离筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：S01:采集玉米根际土壤样品1500g，用无菌袋封装好带回实验室；S02:在超净台内选取10g附着在玉米根系上的土壤，加无菌水至100ml，放入28℃/180r摇床1h，使土壤中菌落均匀分散水中，静置0.5h使土壤颗粒沉淀；S03:吸取上清水稀释至10
‑
2、10
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3、10
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4、10
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5、10
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6倍，分别取200ul涂布于PDA培养基，培养48h后挑取单菌落进行3
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5次纯化，
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80℃保种备用；S04:将纯化后的单菌落于无机磷平板培养，28℃条件下静置培养48h，选取产生透明光圈的单菌落；S05:再将产生透明圈的单菌落于有机磷平板培养，同样选取有透明光圈的单菌落,得到既解有机磷又解无机磷的单菌落，
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80℃保种备用。4.一种促进玉米生长解磷真菌的DNA提取与鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：S01:刮取菌丝覆盖2ml离心管底部，加入CTAB 700ul和研磨珠在研磨仪中研磨，6次，60s/次；S02:研磨均匀后放入65℃水浴1h，每十分钟震荡10s，使CTAB与菌丝充分混匀；S03:取出离心管至常温，放置2分钟后加入600μl氯仿(三氯甲烷)，充分震荡，使CTAB与氯仿充分接触，室温静置2分钟；S04:12000rpm离心15分钟，小心吸取上清液500μl至新的1.5ml离心管中，加入500μl异丙醇，充分混匀可见DNA絮状物，
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20℃放置2小时左右；S05:将
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20C保存的DNA取出，12...

【专利技术属性】
技术研发人员：张恩盈，王光远，徐敏，朱兴建，王文丽，陈子怡，牟欣尚，田晓闽，库婷婷，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：