一种基于3DDNAwalker传感的生物纳米孔检测方法及其在MUC1检测中的应用技术

本发明专利技术提供一种基于3D DNA walker传感的生物纳米孔检测方法及其在MUC1检测中的应用。所述检测方法包括：将带有末端生物素的Zn

【技术实现步骤摘要】
一种基于3D DNA walker传感的生物纳米孔检测方法及其在MUC1检测中的应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学和核酸化学领域，具体涉及一种基于3D DNA walker传感的生物纳米孔检测方法及其在MUC1检测中的应用。

技术介绍

[0002]生物纳米孔单分子检测是纳米、生物、化学、电子信息等多学科交叉融汇而成的一种新兴检测技术。α
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溶血素(α
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Hemolysin，α
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HL)是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分泌的一种分子量为33.2kD的水溶性蛋白质单体，在磷脂双分子层上可组装成分子量为232.4kD的蘑菇型七聚体蛋白质纳米孔，孔道总长约10nm，该纳米孔结构稳定，能够完整的装载在双层脂膜中不漏电，是理想化的纳米孔检测器件。α
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HL纳米孔从几何结构上分为cap、cis、stem三大区域，根据其分子结构或原子图谱，在不同部位进行蛋白修饰，可设计并制造出各种性能的蛋白质纳米管，从而研究空间效应、电荷效应等对通道与不同检测物作用的影响，实现单分子水平上的不同分析物的实时检测。分析物可包括：无机离子、有机分子、单链DNA/RNA、蛋白质等。
[0003]但对于一些特殊的小分子物质检测的灵敏度和特异性有限，如何进行信号放大，以提高检测的灵敏度和特异性，成为本领域技术人员努力攻克的难题。
[0004]另外，乳腺癌是全球妇女癌症死亡的第二大疾病，估计每年死亡人数为626,279人，仅次于肺癌。早期诊断在乳腺癌治疗中具有重要意义，是提高生存率的关键因素。上皮粘蛋白1(Epithelial mucin
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1,muc1)是一种膜糖蛋白，在90％的乳腺癌中过表达，可作为乳腺癌的有效标志物。目前报道的MUC1检测文献主要包括酶联免疫吸附分析、表面增强拉曼分析、荧光分析、电化学分析。然而，现有的方法仍然存在灵敏度低、选择性低、检测成本高的缺点。因此，开发灵敏度高、选择性好、反应条件温和、成本效益高的MUC1检测方法迫在眉睫。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种基于3D DNA walker传感的生物纳米孔检测方法及其在MUC1检测中的应用，该方法利用3D DNA Walker纳米探针放大信号的特点，与生物纳米孔检测结合，能大幅度提高纳米孔检测的灵敏度和信噪比。
[0006]本专利技术提供的基于3D DNA walker传感的生物纳米孔检测方法，所述方法包括：
[0007]1)将带有末端生物素的Zn
2+
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DNAzyme行走链和待测物适配体杂交，然后将其与生物素修饰的发夹底物链分别固定在Fe3O4颗粒上；
[0008]2)待测物与待测物适配体特异性相互作用而释放Zn
2+
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DNAzyme，DNAzyme在Zn
2+
存在下对发夹底物链产生切割，释放底物链DNA片段；
[0009]3)通过磁铁分离Fe3O4颗粒；
[0010]4)释放的DNA片段通过α
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HL生物纳米孔检测DNA片段过孔信号；
[0011]5)获得待测物浓度。
[0012]本专利技术提供的基于3D DNA walker传感的生物纳米孔检测方法在MUC1检测中的应用，所述应用包括步骤：
[0013]A.带有末端生物素的Zn
2+
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DNAzyme行走链和MUC1适配体杂交，然后将其与生物素修饰的发夹底物链分别固定在Fe3O4颗粒上，得到3D DNA walker纳米探针；
[0014]B.待测MUC1与所述3D DNA walker纳米探针中MUC1适配体特异性相互作用而释放Zn
2+
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DNAzyme，DNAzyme在Zn
2+
存在下对发夹底物链产生切割，释放底物链DNA片段；
[0015]C.通过磁铁分离Fe3O4颗粒；
[0016]D.释放的DNA片段通过α
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HL生物纳米孔检测DNA片段过孔信号；
[0017]E.获得MUC1浓度。
[0018]进一步，所述MUC1适配体如SEQ No.1所示；所述Zn
2+
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DNAzyme行走链如SEQ No.2所示；所述生物素修饰的发夹底物链如SEQ No.3所示。
[0019]SEQ No.1：
[0020]GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG；
[0021]SEQ No.2：
[0022]Biotin
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TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCAGGGTATCCAAAGGATCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGT；
[0023]SEQ No.3：
[0024]Biotin
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TTTTTTTTTTTTGACGACGCGTCATCAAAGCTCATACTATrAGAAGAGACTGCCCTTATTACGCGTCGTC。
[0025]进一步，所述步骤A 3D DNA walker纳米探针的制备包括步骤：
[0026]A.1为获得稳定的发夹结构，将发夹底物在95℃下加热10min，然后逐渐冷却到室温；
[0027]A.2将DNAzyme行走链与适配体链混合，在Tris
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HCl缓冲液中37℃孵育2h，得到适配体和行走链互补的双链结构；
[0028]A.3将底物链和预制备的核酸适体行走链分别加入Fe3O4中振荡16h；最后，用磁体去除游离DNA，在Tris
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HCl中重悬。
[0029]进一步，所述DNAzyme行走链与适配体链混合的摩尔比为1:1.2。
[0030]进一步，所述步骤B：待测MUC1与所述3D DNA walker纳米探针中MUC1适配体特异性相互作用而释放Zn
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DNAzyme，DNAzyme在Zn
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存在下对发夹底物链产生切割,在剪刀状rA处水解裂解；发夹底物链被分成两个片段，远离Fe3O4端的DNA被释放。
[0031]进一步，所述待检测DNA片段如SEQ No.4所示。
[0032]SEQ No.4：GAAGAGACTGCCCTTATTACGCGTCGTC。
[0033]进一步，所述α
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HL生物纳米孔的制备包括步骤：
[0034]在peek管内形成二植酰磷脂酰胆碱DPhPC双层膜；所述磷脂双层膜分为顺式和反式两个腔室；在所述腔室两侧加入含有KCl的Tris
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HCl导电缓冲液；用Ag/AgCl电极测量通过纳米孔的离子电流；α
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溶血素蛋白在顺式腔孔附近注入，通过电流值的明确跳跃本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于3D DNA walker传感的生物纳米孔检测方法，其特征在于，所述方法包括：1)将带有末端生物素的Zn
2+
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DNAzyme行走链和待测物适配体杂交，然后将其与生物素修饰的发夹底物链分别固定在Fe3O4颗粒上；2)待测物与待测物适配体特异性相互作用而释放Zn
2+
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DNAzyme，DNAzyme在Zn
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存在下对发夹底物链产生切割，释放底物链DNA片段；3)通过磁铁分离Fe3O4颗粒；4)释放的DNA片段通过α
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HL生物纳米孔检测DNA片段过孔信号；5)获得待测物浓度。2.根据权利要求1所述的基于3D DNA walker传感的生物纳米孔检测方法在MUC1检测中的应用，其特征在于，所述应用包括步骤：A.带有末端生物素的Zn
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DNAzyme行走链和MUC1适配体杂交，然后将其与生物素修饰的发夹底物链分别固定在Fe3O4颗粒上，得到3D DNA walker纳米探针；B.待测MUC1与所述3D DNA walker纳米探针中MUC1适配体特异性相互作用而释放Zn
2+
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DNAzyme，DNAzyme在Zn
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存在下对发夹底物链产生切割，释放底物链DNA片段；C.通过磁铁分离Fe3O4颗粒；D.释放的DNA片段通过α
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HL生物纳米孔检测DNA片段过孔信号；E.获得MUC1浓度。3.根据权利要求2所述的基于3D DNA walker传感的生物纳米孔检测方法在MUC1检测中的应用，其特征在于，所述MUC1适配体如SEQ No.1所示；所述Zn
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DNAzyme行走链如SEQ No.2所示；所述生物素修饰的发夹底物链如SEQ No.3所示。4.根据权利要求2所述的基于3D walker传感的生物纳米孔检测方法在MUC1检测中的应用，其特征在于，所述步骤A 3D DNA walker纳米探针的制备包括步骤：A.1为获得稳定的发夹结构，将发夹底物在95℃下加热10min，然后逐渐冷却到室温；A.2将DNAzyme行走链与适配体链混合，在Tris
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HCl缓冲液中37℃孵育2h，得到适配体和行走链互补的双链结构；A.3将底物链和预制备的核酸适体行走链分别加入Fe3O4中振荡16h；最...

【专利技术属性】
技术研发人员：田荣，殷博华，王德强，王亮，何石轩，方绍熙，周硕，
申请(专利权)人：中国科学院重庆绿色智能技术研究院，
类型：发明
国别省市：