一种蛋清热固化涂覆毛细管电色谱柱的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种蛋清热固化涂覆毛细管电色谱柱的制备方法及应用。这种毛细管电色谱柱的制备方法为：使用新鲜蛋清涂覆毛细管电色谱柱内表面或者已经制备了基质的整体柱的孔表面，经热变性使蛋白质固定化，形成具有一定机械强度、一定厚度的微孔蛋白质涂层，可以被用作为高选择性的开管/聚合物整体毛细管电色谱柱。由于蛋清中含有的卵清蛋白、卵黏蛋白等多种蛋白质，变性后的固定化蛋白质涂层具有独特的立体结构与丰富的分离选择性位点，展现出对手性映异构体、药物等多种样品分离的良好选择性。本发明专利技术的特征为：原料广泛易得、成本低廉；制作方法简便，并且制得毛细管电色谱柱具有高的分离柱效以及优良的分离选择性，具有较大应用潜力。用潜力。用潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种蛋清热固化涂覆毛细管电色谱柱的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及色谱分离的毛细管电色谱方法
，具体地说，是一种蛋清热固化涂覆毛细管电色谱柱的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]毛细管电色谱结合了电泳的高分离效能和色谱技术的高分离选择性双重机制，具有分离效率高、快速、样品用量少等特点。毛细管柱是分离的核心，多种开管柱、填充柱和整体柱的色谱固定相的制备方法已经受到广泛的研究。
[0003]蛋白质是极具吸引力的改性材料，也是毛细管电色谱的常用固定相修饰基团之一。关于蛋白质修饰的高效液相色谱柱的制备及其应用，在我们早期翻译的《高效液相色谱方法发展》(张维冰等译，2001，华文出版社)一书中已经有详细介绍。刘震最早采用在流动相中添加蛋白质，基于蛋白质与毛细管壁硅羟基作用，制备了动态蛋白质修饰的毛细管电色谱柱，并应用于样品分离(《色谱》，1999，刘震)。蛋白质毛细管电色谱固定相具有独特的空间立体选择性，在复杂组分和手性样品的分离中呈现独特的分析效果。目前，已有多种蛋白被用于毛细管电色谱柱的改性及手性固定相的制备，包括牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、糖蛋白及一些酶类。
[0004]目前，已有研究报道利用蛋清中的单一蛋白质制备毛细管电色谱柱，如溶菌酶蛋白包覆的开管柱(Talanta 195(2019)190
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196)，可用于分离肾上腺素、异丙肾上腺素和特布他林对映体等。单一蛋白质固定相制备的色谱柱具有分离选择性明晰，制备重复性好的特点，但相应的其可提供的作用位点的种类和数量有限。另外，已有混合蛋白涂覆毛细管的方法，例如混合脂蛋白在毛细管的内壁表面形成涂层(脂蛋白毛细管涂层及其制备方法，CN 101750449A)，但是该混合蛋白是通过物理吸附或者化学键合固定，并保留蛋白的生物活性和生物相容性。以不同蛋白质、采用不同的固定化方法得到的蛋白质色谱柱(包括HPLC柱和CEC柱)已有商品化产品，并且在手性分离、药物分析等方面得到应用。
[0005]蛋清中天然含有多种蛋白质，最主要的包括卵清蛋白、卵转铁球蛋白、类卵黏蛋白、卵黏蛋白、溶菌酶等。混合的蛋清蛋白可以在92.5℃以上的环境中热变性，形成具有一定强度、厚度，和孔隙结构的胶体。其二级结构和三级结构遭到破坏，得到的蛋清蛋白含有特异性的立体结构与丰富的选择位点。使用天然蛋清作为开管/聚合物整体毛细管电色谱柱能够提供更加丰富的作用位点种类和数量，可极大地拓宽该类型电色谱柱的应用范围，通过发展适当的方法，可以取得更好地分离效果。

技术实现思路
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[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提出一种蛋清热固化涂覆毛细管电色谱柱的制备方法及应用。
[0007]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
[0008]一种蛋清热固化涂覆毛细管电色谱柱的制备方法及应用，其特征在于，其具体制
备步骤包括以下步骤：
[0009](1)蛋清的提取与处理；
[0010](2)蛋清的涂覆；
[0011](3)蛋清的固化；
[0012](4)制备好的毛细管电色谱柱的保存；
[0013](5)毛细管电色谱柱的应用。
[0014]步骤(1)的具体做法是：取新鲜鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋等，分离蛋黄与蛋清并取蛋清液体，未尽部分使用滴管吸取，肉眼可见的系带部分不选取。用60rpm
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500rpm磁力搅拌器搅拌3min
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10min，和/或超声震荡3min
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20min，搅拌至蛋清溶液至质地均匀，并混有少量气泡；在1,000rpm
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10,000rpm下离心3
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10min，优选为5min，然后取上层清澈液体作为蛋清储备液，占总体积的40％
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50％。
[0015]步骤(2)的具体做法是：利用自动注射泵以10μL/min
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180μL/min流速，优选为50μL/min的速度将上述蛋清储备液于15℃
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30℃温度下泵入经NaOH处理后的熔融石英毛细管柱/已经预先原位合成了聚合物基质的毛细管整体柱内,时间为1min
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2h，优选为待柱后有蛋清储备液流出后停止蛋清输送；再使用氮气等惰性气体以0.5mL/min
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5mL/min的吹扫速度用0.1h
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0.5h将未反应完的物质吹出柱外；为了获得更好的蛋白涂覆载量，重复反应液的冲入与吹出的步骤2～3次。
[0016]步骤(3)的具体做法是：蛋清的固化：将涂覆好蛋清的毛细管柱首尾分别插入硅橡胶垫中密封后，放入85℃
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100℃的水浴或油浴中热变性固化，固化时间0.5h
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1h；蛋清热变性固化后形成的涂层均匀，厚度为0.01μm
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0.2μm。
[0017]步骤(4)的具体做法是：将制备好的蛋清涂覆的开管/聚合物整体毛细管电色谱柱用氮气吹干，立即用胶塞封口冷却后置于4℃冰箱中保存。
[0018]步骤(5)的具体做法是：将色谱柱用于手性化合物的分离，或者在反相色谱模式、亲水色谱模式下进行样品的分离。
[0019]特别地，相关步骤的细节为：
[0020]步骤(1)中，可使用一种来源或混合的蛋清溶液，蛋清可以不稀释或者用纯水稀释处理，稀释倍数为体积比1:2
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2:1。
[0021]步骤(2)中，一种可行的熔融石英毛细管柱的内径为25μm,50μm,或75μm，预处理方法为依次用0.1mol/L HCl和1mol/L NaOH溶液冲洗毛细管约0.5h
‑
3h，分别用超纯水冲洗后用氮气吹干备用。
[0022]步骤(2)中，一种可行的聚合物整体柱为内径为25μm,50μm,或75μm的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)
‑
二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)整体毛细管柱，反压为13MPa
–
20MPa(以流动相为5μL/min的甲醇测定)。
[0023]步骤(2)中，一种可行的聚合物整体柱为内径为25μm,50μm,或75μm的甲基丙烯酸丁酯(BMA)
‑
二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)整体柱，反压为13MPa
–
20MPa(以流动相为5μL/min的甲醇测定)。
[0024]步骤(2)中，一种可行的聚合物整体柱为内径为25μm,50μm,或75μm的甲基丙烯酸十八烷醇酯(SMA)
‑
二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)整体柱，反压为13MPa
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20MPa(以流动相为5μL/min的甲醇测定)。
[0025]与现有技术相比，本专利技术的积极效果是：
[0026](1)本专利技术制备得到蛋清热固化涂覆的开管/聚合物整体毛细管电色谱柱，其涂覆材料为天然混合蛋白质，属于包覆蛋白。变性固定后，含有独特立体结构，可提供更为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋清热固化涂覆毛细管电色谱柱的制备方法，其特征在于，具体步骤为：(1)蛋清的提取与处理：取新鲜蛋清(鸡蛋清、鸭蛋清等)，充分搅拌，混匀蛋清，进一步离心处理(转速为1,000rpm
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10,000rpm)，并取出离心管中的上部蛋清(总体积的40％
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50％)备用。(2)蛋清的涂覆：利用注射泵将制备好的蛋清泵入经NaOH预处理后的毛细管中/已经预先原位合成了聚合物基质的毛细管整体柱内，待柱后有液体流出，停止蛋清输送，用氮气吹出毛细管内的多余蛋清，通气时间为0.1h～0.5h。重复上述操作2～3次。(3)蛋清的固化：将涂覆好蛋清的毛细管柱首尾分别插入硅橡胶垫中密封后，放入85℃～100℃的水浴或油浴中热变性固化，固化时间0.5h～1h。(4)制备好的毛细管电色谱柱冷却后置于4℃冰箱中保存。2.如权利要求1所述的一种蛋清热固化涂覆毛细管电色谱柱的制备方法，其特征在于，所述新鲜蛋清为鸡蛋清、鸭蛋清、鹅蛋清等常见蛋清中的一种或几种的混合溶液。蛋清可以不稀释或者用纯水稀释处理。稀释倍数为体积比1:2
‑
2:1。3.如权利要求1所述的一种蛋清热固化涂覆毛细管电色谱柱的制备方法，其特征在于，所述开管毛细管柱为熔融石英毛细管或聚酮醚毛细管，内径为25μm
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75μm；，所述聚合物整体柱为聚甲基丙烯酸酯类整体柱，例如聚甲基丙烯酸缩水甘油酯
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乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：张维冰，张绿叶，钟志华，董子仪，张凌怡，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：