一种气道纤毛上皮细胞缺失的动物模型的构建及应用制造技术

本发明专利技术提供一种气道纤毛上皮细胞缺失的动物模型的构建及应用。具体的，本发明专利技术通过在肺上皮细胞中特异性敲除蛋白质精氨酸甲基转移酶5（Prmt5）基因，成功构建出一种气道纤毛上皮细胞完全缺失的小鼠模型。本发明专利技术还提供两种纤毛细胞完全缺失的体外气道类器官培养方案。该动物模型和体外培养方案可广泛应用于机体发育过程、细胞分化、器官再生和移植等相关研究领域，并在肺病的发病机理、药物开发、药物筛选和诊断治疗等方面有广泛的应用前景。选和诊断治疗等方面有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
Cell Stress [J], 2020.V 4(8): 199
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215.[8] Zhu, F. and L. Rui, PRMT5 in gene regulation and hematologic malignancies. Genes Dis [J], 2019.V 6(3): 247
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257.[9] 沈昊, 张玲, 刘修恒, PRMTs在肿瘤发生、发展中的作用及机制. 中国现代医学杂志 [J], 2020.V 30(01): 45
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51.[10] Fedoriw, A., S.R. Rajapurkar, S. O'Brien, et al., Anti
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tumor activity of the type I PRMT inhibitor, GSK3368715, synergizes with PRMT5 inhibition through MTAP loss. Cancer Cell [J], 2019.V 36(1): 100
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114 e125。

技术实现思路

[0005]1.本专利技术旨在解决现有纤毛细胞缺陷动物模型缺乏的问题，旨在提供一种气道纤毛细胞完全缺失的动物模型。
[0006]2.为解决上述技术问题，本专利技术提供Prmt5基因在建立纤毛细胞缺失小鼠模型中的应用。
[0007]3.本专利技术还提供一种纤毛缺失动物模型的构建方法，其包括如下步骤：1. 通过Prmt5 flox/flox
基因型小鼠和Shh
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Cre基因型小鼠杂交，获得Prmt5
flox/+
基因型小鼠。2. Prmt5
flox/
;Shh
‑
Cre基因型小鼠和Prmt5 flox/flox
小鼠杂交，获得Prmt5 flox/flox;Shh
‑
Cre
基因型小鼠，即为所述纤毛细胞缺失动物模型。
[0008]4.本专利技术还提供一种纤毛细胞缺失的体外3D类器官培养方案和培养条件。具体为，分离纤毛细胞缺失小鼠的大气道上皮祖细胞，将单细胞在50% Matrigel条件下3D培养，所形成的类器官模拟动物体内纤毛细胞完全缺失的现象。
[0009]5.本专利技术还提供一种纤毛细胞缺失的体外2D类器官培养方案和培养条件。具体为，分离纤毛细胞缺失小鼠的大气道上皮祖细胞，将细胞在细胞培养小室内培养，在气
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液交界面培养条件下，细胞分化形成气道假复层上皮结构类器官，所形成的类器官纤毛细胞完全缺失，完美模拟动物体内纤毛细胞缺失的现象。
[0010]6.本专利技术还提供上述方法获得的动物模型和培养方案在纤毛缺陷肺病发病机制和药物筛选等研究中的应用。
[0011]有益效果：本专利技术与现有技术相比，有益效果在于：1.通过细胞特异性基因敲除的方法构建气道纤毛缺失动物模型，不造成肺组织内其它细胞类型的改变，更不会造成其他器官的毒性。而且此方法构建的动物模型，稳定可靠的重复纤毛细胞缺失的现象，应用范围广泛。
[0012]2.本专利技术提供2种体外类器官培养的方法，在体外模拟动物模型体内纤毛细胞缺失的现象，具有可以批量培养、时间周期短和不用牺牲动物等优点，应用潜力大。
[0013]附图说明:图 1为纤毛细胞缺失的动物模型构建方法模式图；A为通过Prmt5 flox/flox
基因型小鼠和Shh
‑
Cre基因型小鼠杂交，获得Prmt5
flox/+
基因型小鼠；B为Prmt5
flox/+
;Shh
‑
Cre基因型雄性小鼠和Prmt5 flox/flox
雌性小鼠杂交，获得Prmt5 flox/flox ;Shh
‑
Cre基因型小鼠。
[0014]图2为Prmt5基因在肺上皮细胞中特异性敲低验证结果图；图2A为蛋白质免疫印迹
法检测对照组和Prmt5敲除组小鼠肺脏中Prmt5蛋白表达情况；图2B为图2A中Prmt5蛋白表达的定量统计（**P<0.01表示，学生t检验）；图2C为用Prmt5和E
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cadherin抗体对对照组和Prmt5敲除组小鼠肺组织免疫荧光染色代表图，E
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cadherin标记肺上皮细胞，Dapi标记细胞核，箭头指示Prmt5的表达，比例尺为20μm。
[0015]图3为来自对照组和Prmt5敲除组小鼠大气道内侧细胞扫描电镜分析结果代表照片，比例尺为10μm。
[0016]图4A为纤毛细胞的分化发育过程模式图；图4B为用c
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Myb和Sox2抗体对E13.5时期对照组和Prmt5敲除组小鼠大气道免疫荧光共染色代表图，箭头指示c
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Myb表达的纤毛祖细胞；图4C为用Foxj1和Sox2抗体对E15.5时期大气道免疫荧光共染色代表图，箭头指示Foxj1表达的上皮细胞；图4D为用ac
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tubulin、CC10和Sox2抗体对E18.5时期对照组和Prmt5敲除组小鼠大气道免疫荧光共染色代表图，箭头指示对照组中的ac
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tubulin表达的纤毛细胞。图4A
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C中Dapi标记细胞核，比例尺为20μm。
[0017]图5为纤毛细胞缺失的3D体外类器官培养过程示意图。
[0018]图6A为对照组和Prmt5敲除组小鼠大气道上皮祖细胞在体外3D条件下培养形成的类器官，比例尺为50μm；图6B为利用Sox2、Krt5、ac
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tubulin（ac
‑
tub）和p63抗体染色对照组和Prmt5敲除组类器官免疫荧光染色代表图，箭头指示对照组中的ac
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tubulin表达的纤毛细胞，Dapi标记细胞核，比例尺为20μm。
[0019]图7为纤毛细胞缺失的2D体外类器官培养过程示意图。
[0020]图8A为2D气
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液交界面培养所形成的类器官免疫荧光染色代表图，箭头指示对照组中的ac
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tubulin和Foxj1表达的纤毛细胞，Dapi标记细胞核，比例尺为20μm；图8B为qRT
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PCR分析2D培养条件下对照组和Prmt5敲除组类器官各种细胞类型标记基因相对表达量，显示Prmt5敲除组形成的类器官表达棒状细胞标记基因CC10，但是不表达纤毛细胞标记基因ac
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tubulin和Foxj1，数据表示为平均
±
SD、ns、不显著、***P<0.001表示，学生t检验。
具体实施方式
[0021]为了使本专利技术的技术方案和实施方式更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术的上述内容做进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Prmt5基因在肺上皮细胞中敲除后气道纤毛上皮细胞缺失的动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将Prmt5
flox/flox
动物和肺上皮细胞特异性表达的Cre动物杂交，获得Prmt5
flox/+
;Shh;Cre基因型动物；2) 将Prmt5
flox/+
;Shh;Cre动物和Prmt5
flox/flox
动物杂交，获的Prmt5基因在肺上皮细胞特异性敲除的纯合子动物；3) Prmt5基因在肺上皮细胞特异性敲除的纯合子动物，即气道纤毛上皮细胞缺失的动物模型。2.一种纤毛细胞缺失的3D体外类器官培养方案和培养基。3.一种纤毛细胞缺失的2D体外类器官培养方案和培养基。4.如权利要求3所述的3D体外培养方法，其特征在于，所述3D培养条件为：50% Matrigel培养；所述3D培养基成分为：Advanced DMEM/F
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12 89%，青链霉素混合液 1%，GlutaMAX 4 mM，NaHCO
3 3.6 mM，HEPES 15 mM，Primocin
TM 100 μg/ml，FBS 5%，EGF 25 ng/ml，Transferrin 5 μg/ml...

【专利技术属性】
技术研发人员：李秋伶，汪菲菲，田小飞，赵健，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：