一种ADAR蛋白细胞内高效结合底物及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种获取ADAR蛋白细胞内高效结合的底物序列的方法及底物序列和应用。所述方法包括如下步骤：S1.细胞准备及蛋白与RNA交联反应；S2.免疫共沉淀及双链RNA消化，连接，和逆转录；S3.cDNA环化、建库和高通量测序；S4.ADAR底物拼装；S5.高效结合底物的评估。本发明专利技术首次开发了一种获取ADAR蛋白细胞内高效结合的底物序列的方法irCLASH，本发明专利技术从实验及生物信息学的角度填补现有ADAR1结合底物研究存在的空缺，与现有其他研究蛋白与RNA相互作用的方法相比，可显著提高嵌合体读长的得率，可最大限度提高了ADAR蛋白作用底物的构建数量，同时缩短实验耗时、简化了实验操作。简化了实验操作。简化了实验操作。

【技术实现步骤摘要】
一种ADAR蛋白细胞内高效结合底物及应用
[0001]本申请为申请号202010158889.1、申请日2020
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03
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09、专利技术名称“一种获取ADAR蛋白细胞内高效结合的底物序列的方法及底物序列和应用”的中国专利技术专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及分子生物学
，具体地，涉及蛋白质与RNA互作
，更具体地，涉及一种ADAR蛋白细胞内高效结合的底物及应用。

技术介绍

[0003]基因突变是许多疾病及癌症发生的关键诱因，目前已经有3000多个基因特定位点的突变与疾病的发生有关联，随着二代测序技术发展，不论是遗传获得性的基因突变还是后天生长发育过程中某些体细胞的基因突变都可以通过二代测序技术获得突变位点信息，并且通过关联分析找到与疾病发生直接相关的突变位点。但目前各种肿瘤在不同的人群中会有不同的突变位点及突变类型，这样开发不同的靶向药物具有一定的难度，而基因疗法可直接对基因的突变位点进行修复。CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)最早发现于细菌免疫系统中，结合cas蛋白抵抗外源病毒的入侵。目前CRISPR/Cas技术已经广泛应用到生物医学及农业学研究中。CRISPR/Cas技术可以在真核细胞基因组水平引入正确编码的全长基因拷贝，也可以沉默产生突变的基因的表达、对突变位点进行定点修复。在2014年已经有第一例报道成功利用CRISPR技术对地中海贫血症进行临床治疗。地中海贫血症由HBB基因突变引起的血红蛋白水平降低造成。该研究团队将患者皮肤成纤维细胞诱导分化成多能干细胞并用CRISPR/Cas9技术修复突变位点，并将修复后的干细胞诱导成红细胞前体细胞并重新移植到患者体内达到治疗目的。但CRISPR/Cas系统也有其不可避免的缺点，该系统需要同时表达Cas蛋白及导向RNA(gRNA)及提供同源修复DNA序列，且在多篇研究报道中都检测出其在DNA水平或RNA水平有明显的脱靶效应，CRISPR/Cas蛋白切割基因组DNA造成DSB(double
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strand break)，脱靶会造成基因组的不稳定性以及不可预测的细胞命运。此外，CRISPR/Cas系统还可能会引发细胞固有免疫反应，例如，金黄色葡萄球菌来源的Cas9蛋白会诱导血液中的T细胞产生炎症反应进而引起组织坏死。CRISPR/Cas系统的严重缺陷造成其临床应用的局限性，故开发更加安全有效的基因疗法是目前具有巨大临床价值的研究。
[0004]A
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to
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I(腺苷到肌苷)RNA编辑是ADAR蛋白家族介导的且在后生动物中广泛存在的一种RNA修饰方式。A碱基发生脱氨基反应转变成I碱基，继而在细胞内被识别成G碱基，故ADAR蛋白可以在RNA水平逆转基因组上的G到A的突变。目前已知的报道中约20,000种G
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to
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A的突变都与疾病的发生发展有关联。相比CRISPR/Cas系统的基因组编辑方法，ADAR介导的RNA水平的可逆的编辑不会影响基因组序列，且可通过改变RNA序列使得突变的蛋白序列得到修复。最新的研究表明利用ADAR2的一段双链RNA底物序列作为ADAR1蛋白招募序列，结合一段特定位点的互补靶向序列构建出adRNA(ADAR guide RNA)可对內源基因特定位点的A
进行编辑。该方法的优势在于其不需表达其他外源蛋白，仅需要将adRNA片段导入到细胞内便可招募细胞內源的ADAR1蛋白发挥编辑功能，该方法不会引起脱靶效应也不会引起细胞固有免疫反应。但该方法目前的局限性编辑效率不够高。为了提高adRNA介导的A
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to
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I编辑效率，最终达到临床治疗的目的，则需要在全基因组水平找出ADAR的高亲和力底物，从而合成更高效的adRNA。但由于ADAR作用的双链RNA底物研究的空缺，使得利用ADAR蛋白结合adRNA修复与疾病相关的G
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to
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A突变方法难以得到广泛的临床应用。同时，目前用于研究蛋白与RNA相互作用的方法，例如hiCLIP和CLASH等，获取的嵌合体比例少且实验耗时长，均无法有效用于ADAR蛋白作用底物信息的获取。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种获取ADAR蛋白细胞内高效结合的底物序列的方法。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供上述方法获得的底物序列。
[0007]本专利技术的再一目的在于提供上述方法和底物序列的应用。
[0008]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
[0009]一种获取ADAR蛋白细胞内高效结合的底物序列的方法，包括如下步骤：
[0010]S1.在细胞中过表达ADAR蛋白，再交联蛋白质和RNA；
[0011]S2.裂解细胞，免疫共沉淀蛋白与RNA交联复合体，消化未被蛋白保护的RNA，用TSAP酶对消化后的RNA进行去磷酸化处理，接着用T4 PNK对RNA的5
’
末端做磷酸化修饰，进行RNA分子间连接，然后对连接后的RNA末端加接头，纯化120kb～200kb大小范围的蛋白及RNA复合体并提取RNA后进行逆转录反应得cDNA；
[0012]S3.以步骤S2获得的cDNA为模板做环化反应，纯化后再线性化并进行两轮PCR扩增，第二轮PCR时在扩增产物两端分别接上测序文库3'接头和5'接头，对构建好的文库进行高通量测序；
[0013]S4.将高通量测序获取的序列信息去接头、质控、基因组对比，将读长比对到转录组，丢弃比对上的读长，保留未比对上的读长并记录为U1；把U1读长比对到基因组并丢弃连续比对上的读长，保留未比对上的读长并记录为U2；把U2读长比对到基因组，把唯一且不连续的比对上的读长记录为嵌合体读长并记录为U3；把U3读长比对到基因组上，并且根据比对结果对U3进行重新组合；把重组之后的读长比对到基因组上，并提取嵌合体读长；再对上述结果进行整合，获得完整的嵌合体读长集；再以嵌合体两条臂读长为中心取交集后再分别与非嵌合体读长取交集，重组后的双臂读长再进行结构预测截取出双链RNA底物序列，分别以左臂L和右臂R为标记注释其序列信息组装出ADAR蛋白的作用底物序列。
[0014]本专利技术开发了一种获取ADAR蛋白细胞内高效结合的底物序列的方法，又称为irCLASH(infrared cross
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linking,ligation,and sequencing of hybrids)，本专利技术从实验及生物信息学的角度填补现有ADAR蛋白结合底物研究存在的空缺；通过实验技术及后续的双链RNA底物的生物信息学组装方法，获取高亲和力的ADAR双链RNA底物。主要为在步骤S2实验上，通过TSAP酶和T4PNK的组合使用，提高RNA分子间的连接效率，进而提高后续嵌合体读长的得率；同时在步骤S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双链核苷酸序列，其特征在于，所述双链核苷酸序列选自如下序列对的任意一对：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75和SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：张锐，杨文兵，宋玉龙，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：