一种热带爪蛙Fosl1蛋白突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种热带爪蛙Fosl1蛋白突变体及其应用。本发明专利技术利用缺失突变技术构建Fosl1蛋白突变体，筛选到突变体Fosl1

【技术实现步骤摘要】
microRNA biogenesis during early development in Xenopus laevis.Genes Dev.2011,25(11):1121
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31)。因此，需要研发一种能够快速、有效建立Fosl1蛋白功能缺失型热带爪蛙模型的技术与方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一个目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种热带爪蛙Fosl1蛋白突变体。
[0006]本专利技术的第二个目的是提供上述热带爪蛙Fosl1蛋白突变体的应用，即所述突变体在构建Fosl1蛋白功能缺失型热带爪蛙模型中的应用，特别是在构建心肌特异性缺失Fosl1蛋白功能的热带爪蛙模型中的应用。
[0007]专利技术人通过对热带爪蛙Fosl1蛋白的主要功能结构域逐一进行缺失突变，构建了3个突变体：Fosl1
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NT、Fosl1ΔDB及Fosl1ΔLZ。并利用报告基因检测系统逐一分析了上述3个突变体对Fos家族蛋白功能的影响，最终发现突变体Fosl1
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NT不但能有效抑制Fosl1蛋白的功能，而且对Fos家族其他蛋白(Fos、FosB及Fosl2)的功能并无显著影响。因此，Fosl1
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NT可作为热带爪蛙Fosl1蛋白的特异性dominant
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negative突变体(dnFosl1)。与以往报道的利用dnAP
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1突变体(A
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Fos)可抑制所有bZIP家族蛋白的功能不同，本专利技术所述dnFosl1突变体利用Fosl1蛋白的N端多肽，能特异性的抑制Fosl1蛋白的功能，而不影响Fos家族其他蛋白的功能。利用本专利技术所述的dnFosl1突变体，结合转基因技术快速建立Fosl1蛋白功能缺失型热带爪蛙模型，具有周期短，效率高等优势，甚至在F0代就有望能筛选到靶蛋白功能缺失型爪蛙品系。所建立的Fosl1蛋白功能缺失型热带爪蛙模型，不但可用于研究Fosl1蛋白相关的疾病机制，而且能为筛选Fosl1蛋白相关疾病的药物及靶向干预疗法提供了重要的模型工具，具有重要的应用价值。
[0008]本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
[0009]一种热带爪蛙Fosl1蛋白突变体，其氨基酸序列如下所示(亦如SEQ ID NO.1所示)：
[0010]MYRDFTGAFPQPDSGCSSHGLRNSGSSPILGTSGMGHSVRLNPPPEDAQQKYPVHTSSGQFIPTLNAITSSQDLNWMIQPSVRPLNLPPYQSPRHGVIRNMGGVLSMGRRRNGEHLSPEEEER。
[0011]所述的Fosl1蛋白突变体的编码序列如下所示(亦如SEQ ID NO.2所示)：
[0012]ATGTACAGAGACTTCACTGGAGCCTTCCCTCAGCCAGATTCGGGGTGCAGCAGCCACGGCCTACGGAACTCGGGATCTTCCCCAATTTTAGGAACTTCAGGAATGGGACACAGCGTCAGACTGAACCCACCACCCGAGGACGCGCAGCAGAAGTATCCAGTTCACACATCCTCGGGTCAATTTATCCCAACATTGAATGCTATCACATCAAGTCAGGACCTTAACTGGATGATCCAACCAAGTGTACGCCCCCTGAATTTACCACCATACCAAAGCCCTCGGCATGGGGTAATCCGTAACATGGGAGGAGTCTTGAGTATGGGGCGAAGGAGAAATGGAGAACATCTGTCACCAGAGGAAGAGGAGCGATAG。
[0013]上述热带爪蛙Fosl1蛋白突变体、其编码序列、含有其编码序列的重组表达载体或工程菌在制备Fosl1蛋白抑制剂中的应用。
[0014]进一步的，在所述的应用中，Fosl1蛋白突变体特异性抑制Fosl1蛋白的转录活性。
[0015]上述热带爪蛙Fosl1蛋白突变体、其编码序列、含有其编码序列的重组表达载体或工程菌在构建Fosl1蛋白功能缺失型热带爪蛙模型中的应用。
[0016]进一步的，所述的应用的具体操作为：将所述的Fosl1蛋白突变体隆到表达载体
中，构建含有Fosl1蛋白突变体的转基因载体，并注射热带爪蛙受精卵的动物极，孵育，筛选成功表达Fosl1蛋白突变体的胚胎，培养至成蛙，获得Fosl1蛋白失活的热带爪蛙品系。
[0017]所述的应用优选为在构建心肌细胞特异性失活Fosl1蛋白的热带爪蛙模型中的应用。
[0018]进一步的，所述的应用的具体操作为：
[0019]S1、根据编码所述的Fosl1蛋白突变体的DNA序列，合成dnFosl1
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T2A
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EGFP融合DNA片段，并将合成的融合DNA片段克隆到pMlc2
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NTR
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T2A
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Dendra2
opt
载体的EcoRI与HpaI酶切位点之间，替换原有载体中的NTRopt
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T2A
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Dendra2
opt
片段，进而构建pMlc2
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dnFosl1
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T2A
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EGFP转基因载体；其中，所述的融合DNA片段中dnFosl1是Fosl1蛋白突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；T2A是连接肽，其核苷酸序列如下所示：GGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCA；
[0020]S2、将步骤S1所制备的pMlc2
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dnFosl1
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T2A
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EGFP转基因载体与I
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SceI归位内切酶共同注射热带爪蛙受精卵的动物极，孵育，筛选心脏特异性表达绿色荧光的F0胚胎，培养至成蛙，获得心肌细胞特异性失活Fosl1蛋白的热带爪蛙品系Tg(Mlc2
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dnFosl1
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T2A
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EGFP)。
[0021]所述的共同注射方式为：500ng转基因载体和20U I
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SceI归位内切酶用无菌水配置成10μL的注射液，每个受精卵注射2nL。
[0022]所述的共同注射用的热带爪蛙受精卵为1细胞期热带爪蛙受精卵。
[0023]所述的孵育为孵育胚胎至45期(St45)。
[0024]所述的筛选采用荧光体式显微镜实现。
[0025]所述的培养所用的培养液为MBS胚胎培养液，优选为0.1
×
MBS胚胎培养液，配制方法为称取NaCl 25.9g、Hepes 11.9g、NaHCO
3 1.0g、KCl 0.4g、MgSO
4 0.5g、Ca(NO3)
2 0.8g、CaCl...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种热带爪蛙Fosl1蛋白突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的热带爪蛙Fosl1蛋白突变体，其特征在于：所述的Fosl1蛋白突变体的编码序列如SEQ ID NO.2所示。3.权利要求1所述的热带爪蛙Fosl1蛋白突变体、其编码序列、含有其编码序列的重组表达载体或工程菌在制备Fosl1蛋白抑制剂中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：在所述的应用中，Fosl1蛋白突变体特异性抑制Fosl1蛋白的转录活性。5.权利要求1所述的热带爪蛙Fosl1蛋白突变体、其编码序列、含有其编码序列的重组表达载体或工程菌在构建Fosl1蛋白功能缺失型热带爪蛙模型中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的应用的具体操作为：将所述的Fosl1蛋白突变体的编码序列克隆到表达载体中，构建含有Fosl1蛋白突变体的转基因载体，并注射热带爪蛙受精卵的动物极，孵育，筛选成功表达Fosl1蛋白突变体的胚胎，培养至成蛙，获得Fosl1蛋白失活的热带爪蛙品系。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的应用为在构建心肌细胞特异性失活Fosl1蛋白的热带爪蛙模型中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的应用的具体操作为：S1、根据编码所述的Fosl1蛋白突变体的DNA序列，合成dnFosl1
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T2A
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EGFP融合DN A片段，并将合成的融合DNA片段克隆到pMlc2
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NTR
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T2A
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Dendra2
opt
载体的EcoRI与HpaI酶切位点之间，替换原有载体中的NTRopt
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T2A
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Dendra2
opt
片段，进而构建pMlc2
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dnFosl1
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T2A
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【专利技术属性】
技术研发人员：齐绪峰，廖珠琴，周毅民，蔡冬青，郑莉，吴海燕，冯珊珊，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：