枳实提取物在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用制造技术

本发明专利技术提供枳实提取物在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用，涉及动物医药领域。在本发明专利技术中，枳实提取物采用如下方法制备：取枳实破碎，采用乙醇水溶液回流提取，除去乙醇，冷冻干燥，得提取物浸膏；将所述提取物浸膏分散于水中，离心，取沉淀冷冻干燥，将上清液采用AB

【技术实现步骤摘要】
枳实提取物在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用


[0001]本专利技术涉及动物医药领域，具体涉及枳实提取物在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)于1971年首次在英国报道，其病原体被命名为“猪流行性腹泻病毒”，中国在1976年第一次报道了此病。猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)引起的一种急性、高度接触性猪肠道传染病，以水样腹泻、呕吐和脱水为主要症状，各年龄阶段的猪均易感。哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪的发病率可达100％，哺乳仔猪群受害最为严重，病死率平均50％左右。已经成为包括中国，日本，韩国，泰国以及菲律宾等亚洲国家养猪业中严重的传染性疾病，造成了巨大的经济损失。
[0003]猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒，基因组全长约为28kb，为有囊膜、不分节段的单股正链RNA病毒。包含5
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帽子结构和3
’
腺苷尾巴结构，包括7个开放阅读框(ORF)，编码3个非结构蛋白(复制酶1a、1b以及ORF3)和4个结构蛋白分别为:150
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220kDa糖基化的刺突(S)蛋白、20
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30kDa膜(M)蛋白、7kDa包膜(E)蛋白和58kDa核衣壳(N)蛋白。目前，对该病的防控以疫苗免疫防控为主。然而，对于新生仔猪和哺乳期仔猪而言，疫苗免疫效果并不理想。因此，寻找具有毒性低、无残留和不产生抗药性等特点的抗病毒药物及其应用技术意义重大。
[0004]枳实(Aurantii Frutus Immaturus)为芸香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)、栽培变种或甜橙(Citrus sinensis Osbeck)的干燥幼果。主产于四川、江西、湖南等地，具有破气消积，化痰散痞的功效，黄酮类化合物为其提取物主要成分，主要有调节胃肠道功能、抗氧化和抗肿瘤等功能。目前还没有关于枳实在制备抗猪流行性腹泻病毒药物的研究报道。现有技术中，缺乏高效的抗猪流行性腹泻病毒的药物。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供枳实提取物在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用。
[0006]本专利技术的目的采用如下技术方案实现：
[0007]本专利技术提供枳实提取物在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用，所述枳实提取物为枳实的黄酮提取物。
[0008]在本专利技术中，所述枳实提取物采用如下方法制备：取枳实破碎，采用乙醇水溶液回流提取，除去乙醇，冷冻干燥，得提取物浸膏；将所述提取物浸膏分散于水中，离心，取沉淀冷冻干燥，将上清液采用AB
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8大孔吸附树脂柱(购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司)分离，收集35
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45％乙醇水溶液的洗脱液，冷冻干燥后与冷冻干燥后的沉淀合并。
[0009]在本专利技术中，回流提取中乙醇水溶液的浓度为60
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80％，回流提取中的乙醇水溶液加入的量为枳实质量8
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12倍，回流次数为两次，每次提取时间为1
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2小时。
[0010]本专利技术还提供一种抗猪流行性腹泻病毒的药物，包括枳实提取物。
[0011]在本专利技术中，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
[0012]优选的，上述抗猪流行性腹泻病毒药物中，所述枳实提取物的质量百分比含量>90％,其应用剂量为0.2
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1mg/mL。
[0013]有益效果：
[0014](1)首次研究发现，枳实提取物具有显著的抗猪流行性腹泻病毒的功效，具体地本专利技术通过qRT
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PCR技术证明了，枳实提取物在细胞实验中展现出显著的抗病毒活性，在1mg/mL的浓度下即可展现出极强的抗猪流行性腹泻病毒(MOI＝0.01)感染作用。同时，发现治疗腹泻的药物氧化苦参碱、防风并不具备抗猪流行性腹泻病毒的效果。
[0015](2)枳实提取物用于抗猪流行性腹泻病毒安全、毒副作用少；枳实提取物来源于枳实，不同于激素、抗生素、化学合成药物等，对机体无明显毒副作用。
[0016](3)枳实提取物用于抗猪流行性腹泻病毒，药物残留低、无污染；枳实提取物属于有机分子化合物，容易被动物机体吸收，生物代谢率高，且排泄无污染。
附图说明
[0017]图1是枳实提取物对Vero CCL
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81细胞的影响，横坐标为枳实提取物的浓度，纵坐标为细胞活力(枳实提取物干预后细胞的浓度与阴性对照细胞浓度的比值)。
[0018]图2是氧化苦参碱(Oxymatrine，缩写为OM)对Vero CCL
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81细胞的影响，横坐标为氧化苦参碱的浓度，纵坐标为细胞活力(氧化苦参碱干预后细胞的浓度与阴性对照细胞浓度的比值)。
[0019]图3是防风提取物对Vero CCL
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81细胞的影响，横坐标为防风提取物的浓度，纵坐标为细胞活力(防风提取物干预后细胞的浓度与阴性对照细胞浓度的比值)。
[0020]图4荧光定量检测枳实提取物在Vero CCL
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81细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性，横坐标为枳实提取物的浓度或者阴性对照(Control)，纵坐标为PEDV的M蛋白的mRNA相对水平(枳实提取物干预条件下PEDV的M蛋白的mRNA水平与阴性对照中PEDV的M蛋白的mRNA水平的比值)。****表示P<0.0001,差异极显著，***表示P<0.001，差异极显著，ns表示差异不显著,下同。
[0021]图5Western Blot测定枳实提取物在Vero CCL
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81细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性。其中，control是阴性对照。1、0.5、0.2mg/mL分别是各泳道上样品对应的枳实提取物干预浓度。
[0022]图6荧光定量检测氧化苦参碱在Vero CCL
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81细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性，横坐标为氧化苦参碱的浓度或阴性对照(Control)，纵坐标为PEDV的M蛋白的mRNA相对水平(氧化苦参碱干预条件下PEDV的M蛋白的mRNA水平与阴性对照中PEDV的M蛋白的mRNA水平的比值)。
[0023]图7荧光定量检测防风提取物在Vero CCL
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81细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性，横坐标为防风提取物的浓度或阴性对照(Control)，纵坐标为PEDV的M蛋白的mRNA相对水平(防风提取物干预条件下PEDV的M蛋白的mRNA水平与阴性对照中PEDV的M蛋白的mRNA水平的比值)。
具体实施方式
[0024]枳实提取物的制备：取枳实于60℃下烘干，粉碎后过80目筛，取筛下部分，得到枳实粉。在枳实粉本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.枳实提取物在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用，所述枳实提取物为枳实的黄酮提取物。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于所述枳实提取物采用如下方法制备：取枳实破碎，采用乙醇水溶液回流提取，除去乙醇，冷冻干燥，得提取物浸膏；将所述提取物浸膏分散于水中，离心，取沉淀冷冻干燥，将上清液采用AB
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8大孔吸附树脂柱分离，收集35
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45%乙醇水溶液的洗脱液，冷冻干燥后与冷冻干燥后的沉淀合并。3.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘斐，李鹏，单衍可，赵冬，杜旭彬，李佳豪，王彬，安达，赵雨婷，姬晶晶，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：