一种比伐芦定原料药及其制剂的质量检测方法技术

本发明专利技术公开了一种比伐芦定原料药及其制剂的质量检测方法。该方法采用特定的缓冲液制备供试品溶液和标准品溶液，分别以供试品溶液和标准品溶液的浓度自然对数为横坐标，以凝血酶抑制百分数(％TI)为纵坐标，获得标准曲线方程和待测品的回归方程。根据标准曲线计算％TI＝45％时的标准品的浓度，将该浓度代入待测品的回归方程，计算得比伐芦定的凝血酶抑制百分数(％TI)。该方法专属性高、准确度高、检测效率高、重现性较好，适用于比伐芦定原料药及其制剂的质量控制。剂的质量控制。

【技术实现步骤摘要】
一种比伐芦定原料药及其制剂的质量检测方法


[0001]本专利技术涉及药物分析检测
，尤其涉及一种比伐芦定原料药及其制剂的质量检测方法。

技术介绍

[0002]比伐芦定(bivalirudin，CAS:128270
‑
60
‑
0，分子式：C
98
H
138
N
24
O
33
)是一种人工合成的抗凝血药物，主要用于成人择期经皮冠状动脉介入治疗(PCI)。比伐芦定是水蛭素的20肽类似物，为凝血酶直接的、特异的、可逆性抑制剂，无论凝血酶处于血循环中还是与血栓结合，本品均可与其催化位点和阴离子结合位点发生特异性结合，从而直接抑制凝血酶的活性。
[0003]目前，关于测定比伐芦定及其制剂的生物活性已报道的主要有两种方法，第一种：采用凝固法，该法根据检测者目测确定纤维蛋白原的凝固时间，受检测者主观干扰较大。第二种：采用紫外分光光度法测定比伐芦定及其制剂的生物活性，该方法受室温影响很大，且无自身振摇功能，分子间接触面积小，反应不充分，重现性低，得到的标准曲线线性差。
[0004]如目前公开的药品标准号为YBH00142019的注射用比伐芦定质量标准中生物活性的测定方法，采用紫外分光光度法，以三水合磷酸氢二钾制备 0.1mol/L的磷酸氢二钾缓冲液(pH7.0)，需利用空白辅料溶液制备高、中、低三个浓度的质量控制溶液，还要进行酶促反应制得系统适用性溶液和样品溶液，该配制过程复杂易混，紫外分光光度计因无法实现控温而导致结果准确度低，重现性较差，且检测效率低。
[0005]另外，标准号JX20160176的质量标准公开了一种注射用比伐芦定活性测定方法：即采用紫外分光光度法，该方法取牛血清白蛋白作为酶的稳定剂，可防止酶的分解和非特异性吸附，但是需通过测定吸光度来确定底物体积、凝血酶体积和供试品储备液的准确浓度，使得不可控因素增加，且紫外分光光度计因无法实现控温而导致重现性较差，导致结果准确度低，重现性差。此外，在加入缓冲液、底物、对照品或供试品后要水浴10
±
5min，加入凝血酶需再水浴20min，其反应时间过长，操作繁琐。
[0006]鉴于上述方法的局限性，本专利公开了一种专属、准确、快速、重现性好的测定比伐芦定及其制剂生物活性的方法，能有效控制比伐芦定及其制剂产品的质量。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供了一种比伐芦定原料药及其制剂的质量检测方法。该方法专属性高、准确度高、检测效率高、重现性较好，适用于比伐芦定原料药及其制剂的质量控制。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]一种比伐芦定原料药及其制剂的质量检测方法，包括以下步骤：
[0010]步骤1：将待测比伐芦定原料药或其制剂与Tris
‑
HCl缓冲液A混合，获得供试品溶液；将比伐芦定标准品与Tris
‑
HCl缓冲液A混合，获得标准品溶液；
[0011]所述Tris
‑
HCl缓冲液A为含三(羟基甲基)氨基甲烷0.03
‑
0.07mol/L、氯化钠10.20g/L、乙二胺四乙酸二钠盐2.80g/L、聚乙二醇60001.0g/L的 pH＝7.60
‑
9.20的Tris
‑
HCl缓冲液。
[0012]步骤2：取Tris
‑
HCl缓冲液A、供试品溶液和标准品溶液分别与凝血酶溶液孵育；然后加入比伐芦定生色底物溶液，再孵育；于405nm处分别测定吸光值，分别以比伐芦定标准品溶液和供试品溶液的浓度的自然对数为横坐标，以％TI为纵坐标，分别获得标准曲线和比伐芦定待测样品的回归方程；
[0013]根据标准曲线，计算％TI＝45％时的标准品溶液的浓度，将该浓度代入比伐芦定样品的回归方程，计算待测比伐芦定原料药或其制剂的凝血酶抑制百分数。
[0014]本专利技术中的比伐芦定及其制剂在检测过程中，采用带有恒温和混合功能的酶标仪，生色底物一端为发色基团(PNA)，凝血酶可将PNA催化解离下来，使被检样品中出现颜色变化，游离的PNA呈黄色，在405nm波长处产生吸收峰，一定时间内，反应产物的吸光度与酶活性呈线性相关，检测由于PNA 释放而导致被检样品在405nm处光吸收的变化，从而确定比伐芦定的活性。
[0015]本专利技术的一些具体实施方案中，所述Tris
‑
HCl缓冲液A为含三(羟基甲基)氨基甲烷0.05mol/L、氯化钠10.20g/L、乙二胺四乙酸二钠盐2.80g/L、聚乙二醇60001.0g/L的pH＝8.40的Tris
‑
HCl缓冲液。
[0016]本专利技术中，所述标准品溶液和供试品溶液的浓度为1.0μg/ml
‑
20μg/ml，更优选为2.5μg/ml
‑
10μg/ml。
[0017]本专利技术中，所述凝血酶溶液由如下方法制得：将100NIH的凝血酶冻干粉，加入纯化水1000μl复溶，再加入9000μlTris
‑
HCl缓冲液A，混匀。
[0018]本专利技术中，对比伐芦定生色底物的种类没有特殊要求，本领域常见的即可，所述比伐芦定生色底物溶液的浓度优选为0.1
‑
1.0mg/ml。
[0019]本专利技术中，所述比伐芦定制剂包括注射用比伐芦定粉剂或比伐芦定注射液。
[0020]本专利技术中，步骤2中所述检测的环境温度为18℃～22℃，具体可为18℃、 20℃或22℃。
[0021]本专利技术中，步骤2中所述孵育为35
‑
39℃振摇孵育50
‑
150s，优选为37℃振摇孵育120s；所述再孵育为35
‑
39℃振摇孵育5
‑
15s，优选为37℃振摇孵育 10s。
[0022]本专利技术中，步骤2中所述加入凝血酶后的孵育为35
‑
39℃振摇孵育 50
‑
150s，优选为37℃振摇孵育120s；所述再孵育为加入生色底物之后于 35
‑
39℃振摇孵育5
‑
15s，优选为37℃振摇孵育10s。
[0023]本专利技术中，于405nm处分别测定吸光值，其中，所述吸光值于再孵育结束后50s～70s进行测定，测定时间具体可为50s、60s或70s。
[0024]本专利技术中，对照品系列溶液，样品系列溶液中被作用的凝血酶抑制百分数(％TI)计算公式为：
[0025]％TIstandard＝(Absblank
‑
Absstandard)*100％/Absblank；
[0026]％TIsample＝(Absblank
‑
Abssample)*100％/Absblank；
[0027]Absblank＝各系列溶液对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种比伐芦定原料药及其制剂的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将待测比伐芦定原料药或其制剂与Tris
‑
HCl缓冲液A混合，获得供试品溶液；将比伐芦定标准品与Tris
‑
HCl缓冲液A混合，获得标准品溶液；所述Tris
‑
HCl缓冲液A为含三(羟基甲基)氨基甲烷0.03
‑
0.07mol/L、氯化钠10.20g/L、乙二胺四乙酸二钠盐2.80g/L、聚乙二醇60001.0g/L的pH＝7.60
‑
9.20的Tris
‑
HCl缓冲液；步骤2：取Tris
‑
HCl缓冲液A、供试品溶液和标准品溶液分别与凝血酶溶液孵育；然后加入比伐芦定生色底物溶液，再孵育；于405nm处分别测定吸光值，分别以比伐芦定标准品溶液和供试品溶液的浓度的自然对数为横坐标，以％TI为纵坐标，分别获得标准曲线和比伐芦定待测样品的回归方程；根据标准曲线，计算％TI＝45％时的标准品溶液的浓度，将该浓度代入比伐芦定样品的回归方程，计算待测比伐芦定原料药或其制剂的凝血酶抑制百分数。2.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述Tris
‑
HCl缓冲液A为含三(羟基甲基)氨基甲烷0.05mol/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：李勇，孙继福，段银，张睿懿，穆娇，张伟，
申请(专利权)人：昆明龙津药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：