与猪骨骼肌卫星细胞增殖相关的circRNA及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种与猪骨骼肌卫星细胞增殖相关的circRNA及其应用。本发明专利技术基于前期转录组测序数据，发现circCSDE1能够在猪肌肉组织中高表达且在不同处理中差异表达；并通过NCBI设计了多条引物进行成环验证，RNA消化酶实验和正反向引物扩增实验证明了circCSDE1的存在；随后通过qPCR技术构建了circCSDE1的组织表达谱和时序表达谱，证实其能在肌肉组织上高表达且表达模式呈先降低后上升的趋势；进一步利用qPCR、EdU染色和CCK

【技术实现步骤摘要】
与猪骨骼肌卫星细胞增殖相关的circRNA及其应用


[0001]本专利技术涉及分子遗传
，具体地说，涉及一种与猪骨骼肌卫星细胞增殖相关的circRNA及其应用。

技术介绍

[0002]肌肉是由定向分化的肌肉细胞组成的初级动物组织。根据肌肉细胞的形状和分布，肌肉可以分为骨骼肌、心肌和平滑肌。肌肉是具有收缩特性的身体和肢体运动的动力来源。此外，肌肉在哺乳动物的消化、呼吸、循环和排泄中也起着关键作用。成肌是一个复杂的生理过程，包括成肌细胞的增殖和分化以及肌管和肌纤维的形成，它会持续整个生命周期。肌生成是由多种转录因子精确调控的，如MEF2、MRF2家族以及肌肉相关的信号通路等。此外，随着研究的深入，发现一些非编码RNA，包括lncRNA、miRNA和circRNA，在肌生成过程中是也起到重要的调控作用。
[0003]CircRNA是由mRNA前体环化形成的一种新型环状内源性RNA。1976年，circRNA首次在马铃薯块茎类病毒中发现。随后的二十年中由于受分子生物学技术的限制，circRNA的分离和验证十分困难。随着高通量测序技术的发展以及生物信息学的运用，证实了circRNAs的广泛存在。2012年，Salzman等通过转录组测序和实验鉴定，首次报道了mRNA能环化产生circRNA。截止到2013年，科研工作者已经从RNA
‑
Seq数据中鉴定出人类、小鼠、线虫中的circRNA数目分别为1950种、1903种和724种。近期的研究表明，circRNA在miRNA调控、编码蛋白、参与转录与翻译及疾病诊断等方面功效显著。
[0004]目前对于circRNA的研究较少，尤其是其对猪骨骼肌发育的调控机制暂不明确，因此，急需寻找能够调控猪骨骼肌卫星细胞生长发育的circRNAs，完善调控猪骨骼肌卫星细胞的非编码RNA领域，从而为猪种的遗传改良提供理论支撑。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种与猪骨骼肌卫星细胞增殖相关的circRNA及其应用。
[0006]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种与猪骨骼肌卫星细胞增殖相关的circRNA(circCSDE1)，所述circRNA对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]第二方面，本专利技术提供所述circRNA作为猪骨骼肌卫星细胞增殖的标志物在制备用于鉴定猪骨骼肌卫星细胞增殖的检测试剂或试剂盒中的应用。
[0008]第三方面，本专利技术提供一对用于检测所述circRNA的特异性引物，包括如SEQ ID NO:2所示的上游引物和如SEQ ID NO:3所示的下游引物。
[0009]第四方面，本专利技术提供用于鉴定猪骨骼肌卫星细胞增殖的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测所述circRNA表达水平的试剂。
[0010]进一步地，所述试剂盒包括SEQ ID NO:2
‑
3所示引物。
[0011]第五方面，本专利技术提供所述circRNA的抑制剂，所述抑制剂为SEQ ID NO:4
‑
5、SEQ ID NO:6
‑
7或SEQ ID NO:8
‑
9所示的siRNA。其中，SEQ ID NO:6
‑
7所示siRNA的干扰效率最
高。
[0012]第六方面，本专利技术提供一种鉴定猪骨骼肌卫星细胞增殖效率的方法，所述方法包括：检测猪骨骼肌卫星细胞中权利要求1所述circRNA的相对表达水平，与对照组相比，在细胞中转染小干扰后，若所述circRNA的相对表达水平显著降低(P<0.05)，则表明猪骨骼肌卫星细胞增殖效率降低；在细胞中转染过表达质粒后，若所述circRNA的相对表达水平升高，则表明猪骨骼肌卫星细胞增殖效率升高。
[0013]进一步地，利用SEQ ID NO:2
‑
3所示引物检测所述circRNA的表达水平。
[0014]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0015]本专利技术通过前期测序筛选，获得了能够在猪肌肉组织中高表达且在不同处理中差异表达的circRNA
‑
circCSDE1，随后通过构建组织表达谱和时序表达谱，发现circCSDE1能够在骨骼肌中高表达且随日龄增加表达量呈先下降后上升的趋势，说明其在猪骨骼肌生长发育过程中发挥着重要作用；进一步通过qPCR、EdU染色和CCK
‑
8试验证明了circCSDE1能够促进猪骨骼肌卫星细胞的增殖。说明circCSDE1可能作为一种新型的生物标志物来鉴定猪骨骼肌卫星细胞的增殖情况，为猪种的遗传改良提供了理论基础，并为针对肌肉生长发育的临床研究提供新的思路和方法。
附图说明
[0016]图1为本专利技术较佳实施例中Sanger测序后获得的circCSDE1的环化位点。
[0017]图2为本专利技术较佳实施例中为RNA酶消化试验，证明该环化RNA具有稳定性。
[0018]图3为本专利技术较佳实施例中正反向引物扩增试验，左泳道为DNAmarker，DNA分子量标准为DL2000，从上到下依次为2000bp、1000bp、500bp、250bp和100bp，左二泳道为以cDNA为模板时的正向扩增产物，左三泳道为以cDNA为模板时的反向扩增产物，右二泳道为以gDNA为模板时的正向扩增产物，右一泳道无扩增产物。
[0019]图4为本专利技术较佳实施例中circCSDE1在0日龄、90日龄和180日龄晋汾白猪背最长肌组织中的表达变化。
[0020]图5为本专利技术较佳实施例中circCSDE1在晋汾白猪各组织上的表达量。
[0021]图6为本专利技术较佳实施例中在猪骨骼肌卫星细胞中circCSDE1的三种小干扰的干扰效率。si
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1为SEQ ID NO:4
‑
5，si
‑
2为SEQ ID NO:6
‑
7，si
‑
3为SEQ ID NO:8
‑
9。
[0022]图7为本专利技术较佳实施例中转染siRNA60h后利用qRT
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PCR检测增殖相关基因的表达变化
[0023]图8为本专利技术较佳实施例中利用EdU染色法检测干扰circCSDE1后对猪骨骼肌卫星细胞增殖能力的影响。
[0024]图9为本专利技术较佳实施例中使用Image J对EdU染色阳性细胞数进行统计分析。
[0025]图10为本专利技术较佳实施例中使用CCK
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8检测干扰circCSDE1后0h、12h、24h、36h、48h、60h时细胞数。
[0026]图11为本专利技术较佳实施例中过表达载体在猪骨骼肌卫星细胞的过表达效率。NC为对照组，OE
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circCSDE1为circCSDE1的过表达组。
[0027]图12为本专利技术较佳实施例中中转染过表达载体60h后利用qRT
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.与猪骨骼肌卫星细胞增殖相关的circRNA，其特征在于，所述circRNA对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。2.权利要求1所述circRNA作为猪骨骼肌卫星细胞增殖的标志物在制备用于鉴定猪骨骼肌卫星细胞增殖的检测试剂或试剂盒中的应用。3.用于检测权利要求1所述circRNA的引物，其特征在于，包括如SEQ ID NO:2所示的上游引物和如SEQ ID NO:3所示的下游引物。4.用于鉴定猪骨骼肌卫星细胞增殖的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测权利要求1所述circRNA表达水平的试剂。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SEQ ID NO:2
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3所示引物。6.权利要求1所述circRNA的抑...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙迪，蔡春波，杨晓奋，张燕伟，安家岐，李娇，崔子旭，史明月，员佳乐，李文霞，杨帅，曹果清，李步高，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：