一种抗CSFVE2蛋白的纳米抗体、融合蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种抗CSFV E2蛋白的纳米抗体、融合蛋白及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。本发明专利技术所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。本发明专利技术利用所述纳米抗体CSFV

【技术实现步骤摘要】
一种抗CSFV E2蛋白的纳米抗体、融合蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种抗CSFV E2蛋白的纳米抗体、融合蛋白及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起猪的一种高度接触性、高致死性传染病。欧美一些发达国家经过严格的净化措施宣布已经消灭了猪瘟，但是对于东亚、东南亚等一些发展中国家猪瘟仍然是养猪业的重要传染病，各国也在寻找不同将其消灭的方法。我国随着猪瘟兔化弱毒株疫苗的长期控制，现在猪瘟在我国主要以隐性感染为主，但也时有猪瘟发生的报道。
[0003]自2018年8月3日首例非洲猪瘟(Africa swine fever，ASF)在沈阳被确诊以来，ASF已相继在我国多个省份发生。而CSF和ASF的临床症状和病理变化极其相似，会干扰彼此的诊断。根据巴西的防控经验，做好ASF的防控有利于CSF的净化，而做好CSF的免疫和防控有利于ASF的诊断和防控。加之目前ASF没有有效的疫苗和治疗措施，在此背景下，更加凸显了CSF控制和净化的重要性。应用准确快捷的能够区分野毒感染和疫苗免疫的鉴别诊断方法，通过阳性猪淘汰等手段逐步实现CSF在规模化猪场的净化是势在必行的。
[0004]20世纪90年代，C.Hamers
‑
Casterman等人发现骆驼科(如美洲驼、单峰骆驼等)动物体内存在一种天然缺失轻链和CH1区的抗体，被称为重链抗体。克隆其重链可变区生产的单域抗体称为VHH(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)，分子量小，只有约15kDa，因此也被称为纳米抗体。这是目前最小的功能抗体片段，可以独立识别抗原。与传统抗体的复杂结构相比，VHH由于体积小和结构简单，具有更好的利用优势。但是目前关于纳米抗体在CSF诊断方法中的应用却未见相关研究报道，也未有商品化产品。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种抗CSFV E2蛋白的纳米抗体、融合蛋白及其制备方法和应用，对CSFV E2蛋白的检测特异性好，可用于生产检测试剂盒，简化生产工艺，降低生产成本，具有很好的市场转化前景。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种抗CSFV E2蛋白的纳米抗体CSFV
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E2
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Nb1，所述纳米抗体CSFV
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E2
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Nb1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术还提供了一种编码上述纳米抗体CSFV
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E2
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Nb1的核酸分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本专利技术还提供了一种包含上述纳米抗体CSFV
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E2
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Nb1和标记位点的融合蛋白。
[0010]优选的，所述标记位点包括生物素化标记位点Avitag。
[0011]本专利技术还提供了一种表达上述融合蛋白的重组质粒，所述重组质粒的基础载体包
括原核表达载体。
[0012]本专利技术还提供了上述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：将上述重组质粒转入感受态细胞内，利用IPTG进行诱导表达，收集包涵体蛋白，纯化后进行所述标记位点的标记。
[0013]本专利技术还提供了上述纳米抗体CSFV
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E2
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Nb1、上述融合蛋白或上述重组质粒在制备检测猪血清中CSFV抗体的试剂中的应用。
[0014]本专利技术还提供了一种检测猪血清中CSFV抗体的阻断法ELISA检测试剂盒，包括：CSFV E2重组蛋白和上述融合蛋白。
[0015]优选的，还包括酶标二抗和TMB显色液。
[0016]优选的，所述CSFV E2重组蛋白的工作液浓度为0.5μg/mL；
[0017]所述融合蛋白的稀释比为1:8000。
[0018]有益效果：本专利技术提供了一种抗CSFV E2蛋白的纳米抗体CSFV
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E2
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Nb1，并公开了所述纳米抗体的氨基酸序列。本专利技术利用所述纳米抗体CSFV
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E2
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Nb1与标记位点构建融合蛋白，利用所述融合蛋白作为一抗抗体，构建了一种检测猪血清中CSFV抗体的阻断法ELISA检测试剂盒。利用本专利技术所述检测试剂盒，检测方法操作简单，为后续将所述纳米抗体和所述融合蛋白应用于CSFV抗体检测的提供了关键的材料，可以简化生产工艺，降低生产成本，具有很好的市场转化前景。经实施例验证，本专利技术所述检测试剂盒，检测灵敏度高、特异性好，可显著提高CSF的检测灵敏度，并配合猪瘟E2亚单位疫苗，尽快实现我国CSF的净化。
附图说明
[0019]图1为第一次扩增VHH，回收700bp处片段；
[0020]图2为第一次扩增VHH，回收700bp处片段；
[0021]图3为第二次扩增VHH，回收400bp处片段为纳米抗体片段；
[0022]图4为转化后收集纳米抗体初始文库；
[0023]图5为验证转化后阳性率，约为90％；
[0024]图6为固相淘选时，第三轮淘选后富集度达到1.3
×
103满足筛选条件；
[0025]图7为粗表达后，通过ELISA验证阳性克隆，选取特异性好的十个进行测序；
[0026]图8为对测序结果进行分析合成质粒后进行表达后上清SDS
‑
PAGE图，其中9个泳道分别代表摸索IPTG诱导浓度和时间：
①
0.5mM+2h、
②
1mM+2h、
③
1.5mM+2h、
④
0.5mM+4h、
⑤
1mM+4h、
⑥
1.5mM+4h、
⑦
0.5mM+6h、
⑧
1mM+6h、
⑨
1.5mM+6h；
[0027]图9为收集菌体重悬后，破碎后的上清的SDS
‑
PAGE结果，泳道信息同图8；
[0028]图10为验证是否为包涵体表达SDS
‑
PAGE结果，9个泳道分别代表：
①
0.5Mm+4h上清、
②
0.5mM+4h沉淀、
③
1mM+4h上清、
④
1mM+4h沉淀、
⑤
1.5mM+4h上清、
⑥
1.5mM+4h沉淀、
⑦
1mM+6h沉淀、
⑧
阴性上清、
⑨
阴性沉淀；
[0029]图11为改变条件，将其诱导为可溶性表达SDS
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗CSFV E2蛋白的纳米抗体CSFV
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E2
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Nb1，其特征在于，所述纳米抗体CSFV
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E2
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Nb1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种编码权利要求1所述纳米抗体CSFV
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E2
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Nb1的核酸分子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种包含权利要求1所述纳米抗体CSFV
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E2
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Nb1和标记位点的融合蛋白。4.根据权利要求3所述融合蛋白，其特征在于，所述标记位点包括生物素化标记位点Avitag。5.一种表达权利要求3或4所述融合蛋白的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的基础载体包括原核表达载体。6.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹志，单虎，秦志华，尹德华，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：