用于抑制细菌毒素以治疗水生动物早期死亡综合征的系统、方法和组合物技术方案

本发明专利技术涉及用于竞争性地抑制在动物系统中表达的细菌毒素，并且优选地，抑制由影响水生动物的病原菌产生的毒素的新型系统、方法和组合物。本发明专利技术一方面包括通过使用截短PirB

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于抑制细菌毒素以治疗水生动物早期死亡综合征的系统、方法和组合物
[0001]本申请要求享有2020年9月5日提交的美国临时申请第62/896,034号的权益和优先权。上述申请的整个说明书和附图特此通过引用整体并入本文。
[0002]序列表
[0003]本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且其特此通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2020年9月4日，名称为“90115
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00491
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AF.txt”，大小为22.9千字节。


[0004]整体而言，本专利技术技术涉及用于竞争性地抑制在动物系统中表达的细菌毒素，并且优选地，抑制由影响水生动物的病原菌产生的毒素的新型系统、方法和组合物。

技术介绍

[0005]急性肝胰腺坏死病(AHND)，也称为早期死亡综合征(EMS)，已成为影响虾养殖的最具破坏性的疾病之一。EMS已经严重影响了中国、越南、马来西亚、泰国、墨西哥等东西半球数个国家的水产养殖业。在一些情况下，EMS的爆发对虾养殖种群造成了80％的惊人损失。EMS是由弧菌(Vibrio)属菌种引起的，其可通过口腔传播。这些弧菌属菌种定植于虾的胃肠道并产生毒素，该毒素导致被称为肝胰腺的虾消化器官的组织破坏和功能障碍。EMS通常会在放养后20至30天内影响后期幼体虾，并经常导致高达100％的死亡率。目前，没有可用的方法来治疗EMS。预防EMS爆发或治疗EMS的传统策略实际上可能会加剧疾病传播。例如，尝试对池塘底部和水体进行全面消毒以杀死可能的EMS病媒实际上可能有助于EMS疾病的流行传播，而不是通过消除潜在的竞争性微生物种群来对其进行控制。
[0006]如上所述，副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)(或弧菌属菌种)是EMS的致病菌株，并含有一个质粒，该质粒编码名为PirAB
Vp
的两基因操纵子。PirA
Vp
毒素和PirB
Vp
毒素，在本文中通常分别称为PirA和PirB，在结构上类似于来自Photorhabidus的杀虫PirA毒素和杀虫PirB毒素。这两种毒素都在虾胃中产生，并通过破坏肝胰腺上皮细胞导致虾死亡。单独的PirA或PirB不会导致死亡，并且仅结合作为PirAB二元毒素时表现出动物毒性。因此，即使PirB被提议包含膜成孔结构域和受体结合结构域两者，单独的重组PirB毒素也不会导致虾病或虾死亡。如图1A所示，要成为活性毒素，PirA和PirB必须相互作用。虽然PirA/PirB的复合物形成已得到证实，但尚不完全清楚这两种毒素如何相互结合。在持续输送一个或多个抑制剂分子的益生菌的帮助下预防PirA/PirB相互作用可能是一种有价值且经济上可持续的EMS疾病预防策略。

技术实现思路

[0007]整体而言，本专利技术技术涉及用于控制致病因子的新策略。本专利技术的一个目的可以包括灭活由靶病原体产生的毒素，从而抑制宿主生物体中的细菌毒素和/或细菌的致病活
性。在一方面，本专利技术技术可以包括用于通过使用基因工程改造供体微生物来治疗或预防早期死亡综合征(EMS)的新型系统、方法和组合物，其中该基因工程改造供体微生物为例如细菌，其表达能够结合到毒素蛋白的功能位点的经修饰的毒素肽或类似重组肽，并且该毒素蛋白可以竞争性地抑制和/或灭活导致EMS的致病性弧菌属菌种产生的毒素。
[0008]本专利技术还涉及基因修饰供体细菌的用途，该供体细菌可以被配置为产生可以竞争性地抑制真核系统中的毒素活性的经修饰的毒素肽。可以进一步改变这些经修饰的毒素肽以竞争性地抑制其相应的由致病因子产生的野生型毒素的活性。在一个优选实施例中，本专利技术可包括用于抑制由病原菌(例如致EMS的弧菌属菌种)产生的毒素的活性的组合物和方法。在一个优选方面，本专利技术涉及产生基因工程改造细菌，并且优选地产生虾共生、内共生或益生菌细菌，其被配置为竞争性地灭活弧菌属菌种产生的毒素，已知这些毒素是EMS的病原体。
[0009]在一方面，本专利技术可包括经修饰的PirB毒素，其被配置为抑制由致EMS的弧菌属菌种产生的PirA/PirB二聚体复合物(有时称为Pir或Pir二元毒素(PirA/PirB))的形成的活性。在一个优选方面，经修饰的PirB毒素可包括截短PirB肽，并且优选地包括编码蛋白质
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蛋白质界面残基的截短PirB，即PirA和PirB之间的氨基酸残基263
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438。在该优选方面，经修饰的PirB毒素可包括截短PirBΔ1
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262肽，其可进一步与分泌信号结构域偶联，如Ybxl分泌信号。
[0010]在另一优选方面，经修饰的PirB毒素可包括截短PirB肽，并且优选地可包括截短PirBΔ1
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262肽，该肽可以在位置276、367或395处包括一个或多个点突变，其增加截短PirBΔ1
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262肽与PirA的结合亲和力。在该优选方面，截短PirBΔ1
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262肽可包括一个或多个选自由以下组成的群组的点突变：F276S、A367T、P395Y或其任何组合。在另一优选实施例中，截短PirBΔ1
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262肽可包括一个或多个选自由以下组成的群组的点突变的组合：F276S/A367T、F276S/P395Y、A367T/P395Y和F276S/A367T/P395Y。
[0011]在另一优选方面，经修饰的PirB毒素可包括被配置为竞争性地抑制PirA/PirB二聚体复合物形成的PirB肽片段。在该优选方面，PirB肽片段可包括与PirA的结合界面的全部或部分。
[0012]在另一方面，本专利技术包括用于通过使用基因工程改造细菌来治疗或预防水生动物如虾EMS的系统、方法和组合物，其中该基因工程改造细菌表达一种或多种经修饰的PirB肽，该经修饰的PirB肽被配置为竞争性地抑制野生型PirA/PirB二聚体复合物的形成的活性，如上所述，二聚体复合物形成致病性二元细菌毒素。在该优选方面，本专利技术包括治疗水生动物EMS的方法，其包括将治疗有效量的截短PirB肽和/或截短PirB肽片段施用于水生动物，并且优选地施用于受致EMS的细菌性病原体感染或易受其感染的虾。在该方面，可以将治疗有效量的经修饰的PirB肽，如截短PirB肽和/或PirB肽片段直接施用于目标动物，或通过经工程改造以表达PirB肽片段的供体细菌施用。
[0013]本专利技术另一方面包括产生含有基因修饰细菌或其孢子的经处理的饲料或液体接种物，其被配置为表达经修饰的PirB肽，该经修饰的PirB肽被配置为竞争性地抑制由弧菌属种群产生的野生型PirA/PirB二聚体复合物的形成的活性，从而预防或治疗EMS的影响。可将经处理的饲料或液体接种物引入病原体易感或受病原体影响的种群，优选地引入水生动物，如在水产养殖中生长的虾。
[0014]本专利技术的另一方面包括通过基因修饰细菌表达经修饰的PirB肽，该基因修饰细菌可以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于治疗水生生物早期死亡综合征(EMS)的组合物，其包含经修饰的PirB肽，其中所述经修饰的PirB肽竞争性地抑制PirA/PirB二聚体复合物的形成。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述经修饰的PirB肽包含截短PirB肽。3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述截短PirB肽包含PirB Δ1
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262肽。4.根据权利要求2至3中任一项所述的组合物，其中所述截短PirB肽包含根据SEQ ID NO.3的氨基酸序列。5.根据权利要求2至4中任一项所述的组合物，其中所述截短PirB肽与分泌信号结构域偶联。6.根据权利要求2至5中任一项所述的组合物，其中与分泌信号结构域偶联的所述截短PirB肽包含与YbxI分泌信号偶联的截短PirB肽。7.根据权利要求2至5中任一项所述的组合物，其中与分泌信号结构域偶联的所述截短PirB肽包含根据SEQ ID NO.4的氨基酸序列。8.根据权利要求5至7中任一项所述的组合物，其中所述分泌信号结构域包含根据SEQ ID NO.14的分泌信号。9.根据权利要求2至8中任一项所述的组合物，其中所述截短PirB肽进一步包含具有选自由以下组成的群组的一个或多个突变的截短PirB肽：F276S、A367T、P395Y或其任何组合。10.根据权利要求2至8中任一项所述的组合物，其中所述截短PirB肽进一步包含选自由以下组成的群组的截短PirB肽：SEQ ID NO.5
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11。11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述PirA/PirB复合物包含二聚体复合物，其中PirA包含根据SEQ ID NO.1的序列，并且PirB包含根据SEQ ID NO.2的序列。12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述EMS是由弧菌(Vibrio)属菌种引起的。13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述水生生物包含虾。14.一种治疗水生动物EMS的方法，其包含将治疗有效量的根据权利要求1至11中任一项所述的经修饰的PirB肽施用于受致EMS的细菌性病原体感染或易受其感染的水生动物，其中所述经修饰的PirB肽竞争性地抑制PirA/PirB二聚体复合物的形成。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述水生生物包含虾。16.根据权利要求14所述的方法，其中所述施用包含施用治疗有效量的供体细菌，所述供体细菌经工程改造以表达根据权利要求1至11中任一项所述的截短PirB肽。17.根据权利要求14所述的方法，其中所述施用包含施用治疗有效量的供体细菌，所述供体细菌经工程改造以表达根据权利要求1至11中任一项所述的截短PirB肽，其中所述供体细菌被掺入经处理的饲料或液体接种物中。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述供体细菌包含益生菌供体细菌。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述益生菌供体细菌包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。20.一种治疗水生生物早期死亡综合征(EMS)的方法，其包括以下步骤：
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产生供体微生物以表达与启动子可操作地连接的编码经修饰的PirB肽的异源多核苷酸，所述经修饰的PirB肽被配置为竞争性地抑制由致EMS的细菌性病原体产生的PirA/PirB二聚体复合物的形成；
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将所述基因修饰供体微生物引入受所述致EMS的细菌性病原体感染或易受其感染的
目标宿主；
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表达所述异源经修饰的PirB肽；以及
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抑制由致EMS的细菌性病原体产生的所述PirA/PirB二聚体复合物的形成。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述经修饰的PirB肽包含截短PirB肽。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述截短PirB肽包含PirBΔ1
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262肽。23.根据权利要求21至22中任一项所述的方法，其中所述截短PirB肽包含根据SEQ ID NO.3的氨基酸序列。24.根据权利要求22至23中任一项所述的方法，其中所述截短PirB肽与分泌信号结构域偶联。25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中与分泌信号结构域偶联的所述截短PirB肽包含与YbxI分泌信号偶联的截短PirB肽。26.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中与分泌信号结构域偶联的所述截短PirB肽包含根据SEQ ID NO.4的氨基酸序列。27.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中所述分泌信号结构域包含根据SEQ ID NO.14的分泌信号。28.根据权利要求22中27中任一项所述的方法，其中所述截短PirB肽进一步包含具有选自由以下组成的群组的一个或多个突变的截短PirB肽：F276S、A367T、P395Y或其任何组合。29.根据权利要求22至27中任一项所述的方法，其中所述截短PirB肽进一步包含选自由以下组成的群组的截短PirB肽：SEQ ID NO.5
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11。30.根据权利要求20所述的方法，其中所述PirA/PirB复合物包含二聚体复合物，其中PirA包含根据SEQ ID NO.1的序列，并且PirB包含根据SEQ ID NO.2的序列。31.根据权利要求20所述的方法，其中所述致EMS的细菌性病原体包含弧菌属菌种。32.根据权利要求20所述的方法，其中所述水生生物包含虾。33.根据权利要求20所述的方法，其中所述供体微生物包含供体细菌。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述供体细菌包含枯草芽孢杆菌。35.一种用于治疗水生生物早期死亡综合征(EMS)的组合物...

【专利技术属性】
技术研发人员：E，
申请(专利权)人：美国卵石实验室公司，
类型：发明
国别省市：