可视化金钱白花蛇PCR检测方法及试剂盒应用技术

本发明专利技术涉及动物源性中药材检测技术领域，是一种金钱白花蛇PCR检测可视化试剂盒及方法，其特点是，包含：线粒体DNA提取体系、特异性PCR反应体系(总体积为50uL)和可视化鉴别试纸条。特异性PCR鉴定方法可对市售金钱白花蛇中药材样本进行真伪鉴别；可视化试纸条鉴定方法是利用引物标记修饰物6

【技术实现步骤摘要】
可视化金钱白花蛇PCR检测方法及试剂盒应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学技术在动物源性中药制品检测领域的应用，具体说是一种金钱白花蛇DNA快速鉴定方法的建立及可视化核酸检测试剂盒的使用，主要用于动物源性中药
‑
金钱白花蛇真伪的快速鉴别。

技术介绍

[0002]金钱白花蛇(Bungarus multicinctus)是目前常用的一种名贵动物源性中药材，它主要是由银环蛇孵出7
‑
10天的幼蛇高温炮制而成。主要的药用价值为治疗风湿瘫痪、小儿惊风抽搐、破伤风、疥癣、梅毒等疾病，其蛇胆也可治疗小儿高烧引起的抽搐痉挛，总体来说，金钱白花蛇的药用价值极高，经济效益可观。
[0003]金钱白花蛇、赤链蛇、赤链华游蛇、金环蛇为同一蛇科动物幼蛇的加工品，后二者外部形态与金钱白花蛇外观极为相似，经过简单加工处理后，仅从外部特征很难鉴别其直伪。由于赤链蛇对生长环境和饲养条件的要求不高，且生命力顽强，因此成为人们大量养殖该蛇的主要原因。当前存在不法商贩用赤链蛇、赤链华游蛇、金环蛇冒充金钱白花蛇制备中药材的现象，由于饲养食材中包含蟾蜍，进食后蛇的口中可能残留有蟾蜍毒液，若此类伪品流入中药材市场不仅将危害到人们的身体健康、侵害消费者的合法权益、更影响我国中药材市场的整体形象和正常运行。基于目前药品安全性与质量监督的需要，有必要对药材中动物源性成分进行真伪检测。
[0004]自上世纪起动物源性中药常用的检测手段统称为“四大鉴定”技术，分别是基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定及理化鉴定。现代常用的检测技术有色谱法、光谱法、随机扩增DNA法、扫描电镜技术等。性状鉴定对于加工后的中药产品不易鉴别，且该鉴定技术对检验人员的要求极高，需检验人员对各物种的细微形态有较强的认识并能够专业分辨，因此该方法存在费时费力、特异性不强等缺点；光谱分析中常阳的方法是红外光谱分析技术，该技术基于每种分子都具有由其组成或结构决定的独一的红外吸收光谱，据此可以对分子进行结构分析和性状鉴定，该方法操作简便、快速但存在成本较高的缺点；色谱分析中常用的方法是薄层层析法，该方法在药品鉴别、杂质检查、含量测定中均运用较为广泛，且效果显著但成本较高；在中药饮片加工过程中，通常会使用高温炮制的方法，而该方法会使蛋白质变性失活从而使酶联免疫反应失效，所以ELISA方法只适合于未加工过的中药制品，对于经过高温炮制加工的中药材鉴定存在灵敏性不强的缺点，应用范围相对较窄。
[0005]随着分子生物学的发展，此项技术被逐渐应用于检测动物源性、植物源性中药材，且效果显著。分子生物学技术特有的优点日益体现，基于该技术的鉴定方法相比传统鉴定技术，特异性强、准确度高、稳定性好，在中药材真伪鉴定方面具有强大的优势和广阔的应用前景。目前，检测动物源性中药真伪的方法所用时间较长，不符合检测实验室对于检测效果高效、检测过程快速的基本要求，不利于广泛推广。
[0006]近儿年，由于胶体金检测试纸条的制作工艺简单、检测过程简使、检验结果准确等特点，这种新兴的检测技术得以发展迅速。目前，该技术已用于检测激素、病毒、细菌、癌症
抗原、合成抗原等上百种抗原物质。随着可检测物质的增多，该技术的应用范围也日益广泛，包括食品检测、生物检测、微生物检测、环境检测和毒品检测等领域。本专利技术所采用的一次性核酸检测试纸条，其特点是试纸条以干片式的形式，可以达到快速、准确、特异地检测待测物的要求，同时这种检测方式不需要依赖大型的仪器设备、对检测人员的专业技能要求不高。
[0007]本专利技术基于分子生物学技术，利用特异性PCR鉴别体系扩增核酸产物，建立金钱白花蛇中药材的检测方法，在此基础上利用胶体金核酸产物试纸条对金钱白花蛇市售样品进行鉴定，提供一种标准化、规范化、可快速鉴定金钱白花蛇真伪的方法。

技术实现思路

[0008]应用现代分子生物学技术，提取金钱白花蛇、赤链蛇、市售样本的基因组DNA；根据《中国药典2020年版》确定金钱白花蛇使用的鉴别引物，在其正向引物的5
’
端标记6
‑
羧基荧光素(6
‑
FAM)，反向引物的5
’
端标记生物素(Biotin)；建立特异性PCR反应体系，反复试验优化反应条件，确定反应体系，建立金钱白花蛇中药材PCR检测标准；进行PCR扩增得到有6
‑
羧基荧光素(6
‑
FAM)和生物素(Biotin)修饰的扩增产物，采用双抗体夹心法试纸条检测待检样品。
[0009]本专利技术建立一种能够准确鉴别、使用方便的金钱白花蛇核酸检测方法，具有节约时间、节省成本和提高效率的特点，并提供制备集“DNA提取试剂、基因检测试剂、阳性标准对照品、可视化试纸条”为“一体”的溯源性核酸检测试剂盒。
[0010]本专利技术的目的是由以下技术方案米实现的：
[0011]金钱白花蛇核酸检测试剂盒，它包含：
[0012]1.DNA提取试剂
[0013]P1溶液50mL，P2溶液30mL，P3溶液15mL，P4溶液50mL，P5溶液50mL，P6溶液30mL；
[0014](1)P1溶液配制：浓度为1moL
·
L
‑1的Tris
‑
Hcl溶液2mL；浓度为0.5moL
·
L
‑1的EDTA溶液4mL；氯化钠(Nacl)粉末1.06g；10％SDS溶液10mL；浓度为20mg
·
mL
‑1的蛋白酶K溶液1mL；上述试剂混合后加入双蒸水定容至200mL；
[0015](2)P2溶液配制：10g SDS粉末加入双蒸水充分溶解，再次加入双蒸水定容至100mL，即配制成10％SDS溶液；
[0016](3)P3溶液配制：200mg蛋白酶K加入双蒸水充分溶解，再次加入双蒸水定容至10mL，即配成20mg
·
mL
‑1蛋白酶K溶液；
[0017](4)P4溶液配制：饱和乙酸钠溶液；
[0018](5)P5溶液配制：异丙醇溶液；
[0019](6)P6溶液配制：灭菌双蒸水。
[0020]2.线粒体DNA特异寡核苷酸引物(根据《中国药典2020版》设计)
[0021]引物1(金钱白花蛇，扩增长度565bp)
[0022]Forward primer：5
′
GAAATTTCGGCTCTATGCTTATAACCTGTCTTT3
′
[0023]Reverse primer：5
′
GGAATCTTATCGATATCTGAATTAGTA3
′
[0024]引物2(金钱白花蛇，扩增长度565bp)
[0025]Forward primer：5
′
GAAATTTCGGCTCTATGCTTATAACCTGTCTTT3
′
[0026]Reverse primer：5
′
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种金钱白花蛇核酸检测试剂盒，其特征是，它包含：(1)线粒体DNA提取体系：P1溶液50mL，P2溶液30mL，P3溶液15mL，P4溶液50mL，P5溶液50mL，P6溶液30mL；(2)金钱白花蛇阳性对照品：紫外灯下切割金钱白花蛇特异性DNA片段，进行凝胶回收，测定其浓度；转化大肠杆菌后涂板37℃恒温培养箱过夜培养；进行蓝白斑筛选后转入LB液体培养基，置于37℃恒温气浴振荡器中培养过夜；质粒小提，测定其DNA浓度。选取浓度超过100ng/μL的样本交由生工生物工程(上海)股份有限公司测序分析。分析测序结果，并将提取的质粒经PCR鉴定后稀释一定浓度作为试剂盒的阳性对照品。(3)特异性PCR反应体系：鉴定反应体系；阳性对照反应体系(1管)，金钱白花蛇(J
‑
金阳)，50μL；阴性对照反应体系(1管)，50μL。(a)鉴定反应体系：总体系为50μL，其中含有反应缓冲液(10
×
)5μL，dNTP(2.5mmol
·
L
‑1)2
‑
5μL，MgCl2(2.5mmol
·
L
‑1)3μL，Taq DNA聚合酶1
‑
5μL，25％PVP
‑
40溶液5μL，牛血清白蛋白溶液(10mg
·
mL
‑1)2μL，引物1或引物2(10μmol
·
L
‑1)1
‑
3μL，待检样本DNA 1
‑
5μL，其余为双蒸馏水；(b)阳性对照反应体系：总体系为50μL，其中含有反应缓冲液(10
×
)5μL，dNTP(2.5mmol
·
L
‑1)2
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5μL，MgCl2(2.5mmol
·
L
‑1)3μL，Taq DNA聚合酶1
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5μL，25％PVP
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40溶液5μL，牛血清白蛋白溶液(10mg
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mL
‑1)2μL，引物1或引物2(10μmol
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‑1)1
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3μL，金钱白花蛇样本DNA 1
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5μL，其余为双蒸馏水；(c)阴性对照反应体系：总体系为50μL，其中含有反应缓冲液(10
×
)5μL，dNTP(2.5mmol
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‑1)2
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5μL，MgCl2(2.5mmol
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‑1)3μL，Taq DNA聚合酶1
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5μL，25％PVP
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40溶液5μL，牛血清白蛋白溶液(10mg
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mL
‑1)2μL，引物1或引物2(10μmol
·
L
‑1)1
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘琳，艾金霞，李明成，李亚茹，周童，孟媛，吴楠，崔琳，
申请(专利权)人：北华大学，
类型：发明
国别省市：