一种利用一次性片状载体反应袋生产口服轮状病毒疫苗的工艺制造技术

一种利用一次性片状载体反应袋生产口服轮状病毒疫苗的工艺，本发明专利技术为五价轮状病毒减毒活疫苗，含有G1、G2、G3、G4、G9五种主要流行血清型，涵盖了A组轮状病毒90%的主要流行株；疫苗有效成分为：G1、G2、G3、G4、G9抗原，各血清型滴度为1

【技术实现步骤摘要】
一种利用一次性片状载体反应袋生产口服轮状病毒疫苗的工艺


[0001]本专利技术涉及疫苗生产
，尤其是一种利用一次性片状载体反应袋生产口服轮状病毒疫苗的工艺。

技术介绍

[0002]目前已上市轮状病毒疫苗中有兰州所单价羊株、默沙东人牛重配5价轮状，以及GSK单价减毒活疫苗。目前轮状病毒主要流型株为G1、G2、G3、G4、G9，单价苗难以同时覆盖多个流型株，默沙东虽然是五价产品，但因缺少G9血清型抗原，覆盖范围有限。
[0003]轮状病毒的实验室培养方法发展至今，已较为成熟。但方瓶、细胞工厂和转瓶的培养方法有很大的局限性。平行放大时工作量大，操作污染风险高，瓶间差异大，不能实时对关键工艺参数进行控制，质量控制难，生产效率难以提高。
[0004]微载体培养工艺发展至今，也较为成熟。但培养密度提升有限，培养液置换困难，限制了在轮状病毒培养方向上的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于解决现有技术存在的不足，而提供一种利用一次性片状载体反应袋生产口服轮状病毒疫苗的工艺。
[0006]本专利技术的技术方案为：一种利用一次性片状载体反应袋生产口服轮状病毒疫苗的工艺，本专利技术为五价轮状病毒减毒活疫苗，含有G1、G2、G3、G4、G9五种主要流行血清型，涵盖了A组轮状病毒90%的主要流行株；疫苗有效成分为：G1、G2、G3、G4、G9抗原，各血清型滴度为1
‑
5X10^6个活性单位/ml；其中病毒保护剂为：蔗糖50
‑
75g/L，磷酸氢二钾1
‑
1.5g/L，磷酸二氢钾0.4
‑
0.6g/L，谷氨酸单钠盐0.8
‑
1.0g/L，氯化钙10
‑
20mMg/L；包括以下步骤：1)浸润片状载体：将贴壁细胞培养基加入到片状载体袋并使其达到工作体积，通5
‑
10％CO2的混合气体后，将片状载体袋放入摇床，平衡时间在5h以上或过夜，以便浸润片状载体；设定摇床：温度为37
±
0.5℃，摇摆速度8
‑
12rpm，摇床角度5
‑
10
°
。
[0007]2)接种并培养贴壁细胞。
[0008]3)接种细胞浓度1
‑
9E+5个/ml。
[0009]4)接种参数：温度37
±
0.5℃，摇摆速度2
‑
55rpm，摇床角度2
‑
15
°
，3
‑
8％CO2的混合气体。
[0010]5)混匀：向平衡后的片状载体袋接种细胞后，片状载体袋内浑浊，显微镜下看到大量未贴壁细胞，将片状载体袋置于摇床上，同时通3
‑
8％CO2的混合气体后，混匀2
‑
100分钟；摇床设置：摇摆转速2
‑
55rpm，温度37
±
0.5℃，摇床角度2
‑
15
°
。
[0011]6)细胞贴壁：混匀后静置或低转速角度培养0.5
‑
4h观察袋内液体澄清。
[0012]7)细胞培养：袋内澄清后，摇床设置为摇摆转速设为10rpm，温度37
±
0.5℃，摇床角度5
‑
10
°
，通3
‑
8％CO2的混合气体；自第二天开始，开启培养基灌流，每天灌流体积为0.5
‑
3个工作体积，每天取样测糖浓度，并计算日糖耗，维持糖浓度在1.0g/L以上，培养2
‑
7天。
[0013]8)当细胞生长到2
‑
7天时，对片状载体袋内的细胞进行1
‑
5次长时消化。
[0014]9)消化：加入DPBS混匀排出，重复1
‑
3次，排出DPBS。
[0015]10)加入胰酶消化液，浸润片状载体，消化1
‑
60min后排出胰酶，加入无血清培养基，拍打袋子，使细胞从片状载体上脱落，排出并收集细胞悬液，重复此步骤1
‑
3次，取样，计数，计算细胞活力，镜下观察细胞形态和分散程度。
[0016]11)转移：将消化后收集合并的细胞以一定细胞的密度接种到已提前平衡过夜的2
‑
20倍体积的片状载体袋中。
[0017]12)其中，对片状载体袋内的细胞进行1
‑
15次短时消化，每次消化的消化时间优选为1
‑
40min。
[0018]13)重复步骤2)
‑
7)至细胞生产到对数生长后期或平台期。
[0019]14)当细胞生长到2
‑
7天时，细胞数量进入对数生长后期或平台期时，取片状载体用柠檬酸结晶紫法计数。
[0020]15)将PBS预热到室温至37
±
0.5℃，将袋内培养基排出，加入1个工作体积的PBS，混匀，排出，重复洗换1
‑
3次，排出PBS后换入提前温育好的含0.5
‑
10μg/ml胰酶的维持液，按照病毒感染复数（MOI）0.001
‑
0.1计算接毒量。
[0021]16)取计算好的接毒量向上取整，加入胰蛋白酶使其终浓度为5
‑
25μg/ml，37
±
0.5℃ 温育0.5
‑
2小时，期间晃动病毒液3
‑
6次。
[0022]17)取激活完成的病毒液加入袋子中，充分混匀，关闭进出液口，调整运行参数为：转速2
‑
20rpm，角度2
‑
12
°
，温度37
±
0.5℃，溶氧20
‑
80%，pH为7.0
‑
7.8。
[0023]18)接毒后第二天开启维持液灌流培养，灌流体积为0.5
‑
3个工作体积/天。
[0024]19)维持液收获到收获液桶中，可放置在2
‑
8℃环境中。
[0025]20)继续培养，待培养至细胞脱落达到60%以上时，停止病毒培养；将袋子其他管道断开，连同收获液桶一块放入零下15℃以下环境中冻存，室温融化，如此反复进行1
‑
3次，裂解细胞，释放病毒。
[0026]21)细胞破碎完成后，进行澄清过滤，可采用1.0
‑
0.8μm套筒过滤器过滤，除去细胞碎片。
[0027]22)澄清过滤后，根据病毒含量和培养基成分，可进行超滤浓缩，采用300KD孔径膜包，对澄清后病毒液进行10
‑
20倍浓缩，浓缩后加入病毒保护剂，也可在收获液中加入。
[0028]23)加入病毒保护剂后为病毒原液。
[0029]进一步的，所述的贴壁细胞培养基为含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用一次性片状载体反应袋生产口服轮状病毒疫苗的工艺，其特征在于：本发明为五价轮状病毒减毒活疫苗，含有G1、G2、G3、G4、G9五种主要流行血清型，涵盖了A组轮状病毒90%的主要流行株；疫苗有效成分为：G1、G2、G3、G4、G9抗原，各血清型滴度为1
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5X10^6个活性单位/ml；其中病毒保护剂为：蔗糖50
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75g/L，磷酸氢二钾1
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1.5g/L，磷酸二氢钾0.4
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0.6g/L，谷氨酸单钠盐0.8
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1.0g/L，氯化钙10
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20mMg/L；包括以下步骤：1)浸润片状载体：将贴壁细胞培养基加入到片状载体袋并使其达到工作体积，通5
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10％CO2的混合气体后，将片状载体袋放入摇床，平衡时间在5h以上或过夜，以便浸润片状载体；设定摇床：温度为37
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0.5℃，摇摆速度8
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12rpm，摇床角度5
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10
°
；2)接种并培养贴壁细胞；3)接种细胞浓度1
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9E+5个/ml；4)接种参数：温度37
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0.5℃，摇摆速度2
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55rpm，摇床角度2
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15
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，3
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8％CO2的混合气体；5)混匀：向平衡后的片状载体袋接种细胞后，片状载体袋内浑浊，显微镜下看到大量未贴壁细胞，将片状载体袋置于摇床上，同时通3
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8％CO2的混合气体后，混匀2
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100分钟；摇床设置：摇摆转速2
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55rpm，温度37
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0.5℃，摇床角度2
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15
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；6)细胞贴壁：混匀后静置或低转速角度培养0.5
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4h观察袋内液体澄清；7)细胞培养：袋内澄清后，摇床设置为摇摆转速设为10rpm，温度37
±
0.5℃，摇床角度5
‑
10
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，通3
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8％CO2的混合气体；自第二天开始，开启培养基灌流，每天灌流体积为0.5
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3个工作体积，每天取样测糖浓度，并计算日糖耗，维持糖浓度在1.0g/L以上，培养2
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7天；8)当细胞生长到2
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7天时，对片状载体袋内的细胞进行1
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5次长时消化：9)消化：加入DPBS混匀排出，重复1
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3次，排出DPBS；10)加入胰酶消化液，浸润片状载体，消化1
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60min后排出胰酶，加入无血清培养基，拍打袋子，使细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊知昂，
申请(专利权)人：上海柏澳得生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：