一种生物合成人体结构性材料的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种生物合成人体结构性材料的制备方法。本发明专利技术提供了一种重组IV型人源化胶原蛋白，其氨基酸序列包含n个重复序列，n为大于等于1的整数；其中，所述重复序列为人天然IV型胶原蛋白的功能区序列。本发明专利技术提供了能够在体外正确表达的重组IV型人源化胶原蛋白的氨基酸序列，并且成功在体外进行了生物合成，该蛋白的氨基酸序列源于天然人IV型胶原蛋白，用于人体不会产生不良免疫反应，并且相比商品化的人源胶原蛋白，本发明专利技术制备的重组IV型人源化胶原蛋白具有更高的细胞黏附效果。同时，本发明专利技术提供的制备方法简单，在低成本下即可获得较高产量的重组IV型人源化胶原蛋白。可获得较高产量的重组IV型人源化胶原蛋白。可获得较高产量的重组IV型人源化胶原蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种生物合成人体结构性材料的制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种生物合成人体结构性材料的制备方法。

技术介绍

[0002]人体结构性材料主要是包含胶原蛋白的结构性蛋白，这类蛋白对细胞、组织具有黏附、支撑功能，是主要的细胞外基质组成成分。
[0003]胶原蛋白是广泛分布于人体结缔组织的一类蛋白质，也是人体含量最多的蛋白质，可以占到蛋白质总量的25％～35％，目前发现人体至少有28种胶原蛋白亚型，分别位于不同组织器官。其中，Ⅳ型胶原蛋白主要存在于肝门静脉血管区，中央静脉周围，沿着窦状隙分布，是构成基底膜骨架的重要成分，其呈非纤维网状胶原蛋白三螺旋结构，发挥细胞外基质作用，对细胞有支撑能力。胶原蛋白是天然的生物资源，具有其它高分子材料望尘莫及的生物组织相容性，因此可以作为重要的人体结构性材料，广泛的应用在高端医药行业。
[0004]然而，目前胶原蛋白原材料主要源自于动物组织提取，遗憾的是，Ⅳ型胶原蛋白在动物体内含量低，致使无法提取到Ⅳ型胶原蛋白单一成分。同时，动物源性免疫反应也是导致胶原蛋白在应用中受限的重要原因。随着我国胶原蛋白产业的日益壮大，利用生物合成路径获得胶原蛋白日趋成熟，尤其是人源化胶原蛋白已经走在世界前列。2021年国家药监局对生物合成胶原蛋白做了命名分类，其中，重组人源化胶原蛋白是指由DNA重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合。
[0005]在生物体中，Ⅳ型胶原蛋白是一种非纤维状三螺旋结构，有六种遗传上不同的α链：α1(Ⅳ)
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α6(Ⅳ)，会在组织中形成三种不同的分子形式，即α1α1α2(Ⅳ)、α3α4α5(Ⅳ)和α5α5α6(Ⅳ)，它们能够在不同阶段的特定组织中选择性的在不同的膜中表达。从结构上来说，人体天然的Ⅳ型胶原蛋白的结构非常的复杂，所以才导致人源化胶原蛋白极难通过常规手段表达和大量制备。胶原蛋白的合成和修饰从原胶原开始，经历了羟基化、糖基化、相互交联等诸多化学变化，受到了多种生物酶的复杂调控。原胶原除了含有胶原链之外，还含有球状的头部和尾部。没有这些头部和尾部，胶原链就不会折叠成为正确的三螺旋，从而缺乏胶原蛋白的生物学活性。因此，按照原始基因序列制备的胶原蛋白无法在体外自发的组织形成正确的空间结构。这样的困难严重阻碍了人源化胶原蛋白的研发和生产。
[0006]生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱、酶解法处理动物来源的组织，提取胶原蛋白衍生物。这些方法提取的胶原蛋白本身已经丧失了原本的生物学活性，无法应用于生物医学领域发挥真正的功能。随着现代生物技术的发展，人们不断尝试利用转基因技术，在动物、植物和微生物表达体系中制备重组人胶原蛋白，解决了传统提取工艺的诸多缺点。但是也有研究机构指出，人体B细胞中可表现出来的受体在小鼠中未表达出来，所以表明人源化的模型可以提供使用常规小鼠无法获得的表达。所以亟需一种可以克服该缺陷的人源化Ⅳ型胶原蛋白生物合成方法，使其可作为人体结构性材料得到广泛应用。

技术实现思路

[0007]专利技术要解决的问题
[0008]本专利技术拟提供一种重组IV型人源化胶原蛋白，并提供其生物合成制备方法，及其在医药领域的用途，用以解决天然人Ⅳ型胶原蛋白在体外无法正确表达并大量制备的问题，为人源化胶原蛋白的生产应用提供新的可能。
[0009]用于解决问题的方案
[0010]本专利技术的第一方面提供一种重组IV型人源化胶原蛋白。具体来说，本专利技术筛选了人天然IV型胶原蛋白的功能区的序列，并将其作为重复序列，使所述重组IV型人源化胶原蛋白的氨基酸序列包含n个重复序列即人天然IV型胶原蛋白的功能区序列，n为大于等于1的整数。重组IV型人源化胶原蛋白由一种人天然IV型胶原蛋白的功能区的序列组成。
[0011]进一步的，所述n可以为1、2、3、4、5、6、7或8，其中，当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间直接连接；从而可以获得氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示序列的重组IV型人源化胶原蛋白。
[0012]更进一步的，为了方便所述重组IV型人源化胶原蛋白在实际生产过程中的表达和纯化，本专利技术提供的重组IV型人源化胶原蛋白的氨基酸序列还可以包含能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列，所述能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；可选的，所述能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列与所述重复序列直接连接；优选的，所述能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列位于所述重组IV型人源化胶原蛋白的N末端。
[0013]本专利技术还提供了以上述氨基酸序列为核心区域的重组IV型人源化胶原蛋白。
[0014]本专利技术的第二方面提供编码本专利技术第一方面中所述重组IV型人源化胶原蛋白的多核苷酸。
[0015]进一步的，所述多核苷酸的序列可以包含如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的序列，或其根据人工设计和密码子优化后的衍生物。
[0016]本专利技术的第三方面提供一系列包含本专利技术第二方面中所述多核苷酸的重组表达载体。本专利技术选择的表达载体可以在原核或真核细胞的各种宿主中稳定存在并可自主复制，如本领域中的常规质粒(pET系列)、穿梭载体PNV 18.1、噬菌体或病毒载体等。在载体上通过酶切、连接等分子生物学操作，将本专利技术第二方面中所述的核苷酸序列克隆到载体中，构建得到重组表达载体。
[0017]本专利技术的第四方面提供一系列包含本专利技术第三方面中所述重组表达载体的重组宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞、酵母或真核细胞，进一步可以选自大肠杆菌、赤红球菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌。将本专利技术第三方面中所述的重组表达载体转化至宿主细胞中，获得相应的基因工程菌。
[0018]本专利技术的第五方面提供本专利技术第一方面中所述重组IV型人源化胶原蛋白的制备方法，其可以包括如下步骤：
[0019]S1：发酵培养本专利技术第四方面所述的重组宿主细胞，诱导蛋白表达；在该步骤中，所述发酵培养可选在转速为200
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240rpm、温度为35
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38℃的摇床中进行，优选转速为220rpm，优选温度为37℃；所述诱导蛋白表达的具体程序可选为：降温至16
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30℃并添加IPTG，可选的IPTG的工作浓度为0.3
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0.7mM，优选为0.5mM；
[0020]S2：收集所述蛋白；在该步骤中，所述收集所述蛋白的具体程序可选为：将S1步骤
所得到的混合物于4℃环境下5000
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7000rpm离心10
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15min，利用含有20
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30mM Tris、150
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250mM氯化钠和15
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25mM咪唑的水溶液重悬沉淀，高压均质或超声破碎细胞后于4℃环境下15000
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18000rpm离心20
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组IV型人源化胶原蛋白，其特征在于，所述重组IV型人源化胶原蛋白的氨基酸序列包含n个重复序列，n为大于等于1的整数；其中，所述重复序列为人天然IV型胶原蛋白的功能区序列；优选的，所述n为1、2、3、4、5、6、7或8，其中，当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的；更优选的，所述重组IV型人源化胶原蛋白的氨基酸序列包含如下(i)
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(iii)中的任一项：(i)如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；(ii)在如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或修饰1个或多个氨基酸残基并且保留人天然IV型胶原蛋白的细胞黏附效果的氨基酸序列；(iii)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留人天然IV型胶原蛋白的细胞黏附效果，所述严格条件是中等严格条件，中
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高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。2.根据权利要求1所述的重组IV型人源化胶原蛋白，其特征在于，所述重组IV型人源化胶原蛋白的氨基酸序列还包含能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列，所述能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；优选的，所述能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列与所述重复序列直接连接；优选的，所述能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列位于所述重组IV型人源化胶原蛋白的N末端。3.一种编码权利要求2所述的重组IV型人源化胶原蛋白的多核苷酸；优选的，所述多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的序列。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求3所述的多核苷酸；优选的，所述重组表达载体包括pET系列载体、穿梭载体、噬菌体或病毒载体；更优选的，所述重组表达载体为pET
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【专利技术属性】
技术研发人员：金雪坤，兰小宾，王玲玲，张永建，杨霞，
申请(专利权)人：山西锦波生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：