核酸扩增方法技术

本发明专利技术提供一种高灵敏度且高产量的利用RNA的核酸扩增方法。该核酸扩增方法包括通过逆转录反应由样本RNA合成cDNA的步骤和利用多重PCR扩增该cDNA的步骤，该逆转录和该多重PCR在单链核酸结合蛋白的存在下进行，该单链核酸结合蛋白为T4GP32或其变异体。结合蛋白为T4GP32或其变异体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸扩增方法


[0001]本专利技术涉及一种核酸扩增方法。

技术介绍

[0002]多重PCR是通过同时使用多个引物对的PCR反应而从1个DNA样本同时扩增多个区域的方法。将从RNA向cDNA的逆转录(RT)反应与多重PCR组合而成的多重RT－PCR已被利用于基因表达分析和基因分型等。
[0003]RNA通常从组织样本中提取。另外，作为更简便且非侵入的RNA提取方法，最近公开了从皮肤表面脂质(skin surface lipids；SSL)中提取RNA的方法(专利文献1)。SSL所含的RNA作为用于基因表达分析等的RNA样本是有用的。然而，能够从1个被检测体中回收的SSL的量不多，并且其中所含的RNA的量也不多，因此利用1个被检测体的SSL能够制备的RNA的量是微量的。
[0004]在非专利文献1中记载了BSA和T4 gene 32protein(T4GP32)改善了在抑制物质存在下的PCR反应。在非专利文献2中记载了DMSO和甜菜碱提高了PCR的特异性和产量。在非专利文献3、4中记载了在RT－PCR时，通过向RT体系添加T4GP32，RT－PCR产物的产量显著增加了，但即使向RT后的PCR体系添加T4GP32，也观察不到明显的产量增加。在专利文献2中记载了在以RNA为模板扩增cDNA的扩增逆转录法(RT－RamDA法)中，通过使T4GP32与从模板RNA剥离的单链cDNA结合，保护该cDNA不被核酸酶分解，从而增加cDNA的产量。
[0005](专利文献1)国际公开公报第2018/008319号
[0006](专利文献2)国际公开公报第2016/052619号
[0007](非专利文献1)Appl Environ Microbiol,1996,62(3):1102－1106
[0008](非专利文献2)PLOS ONE,2010,5(6):e11024
[0009](非专利文献3)Appl Environ Microbiol,1998,64(2):669－677
[0010](非专利文献4)BioTechniques,2001,31(1):81－86

技术实现思路

[0011]本专利技术提供一种核酸扩增方法，其包括：通过逆转录由样本RNA合成cDNA的步骤；和利用多重PCR扩增该cDNA的步骤，该逆转录和该多重PCR在单链核酸结合蛋白的存在下进行，该单链核酸结合蛋白为T4GP32或其变异体。
[0012]本专利技术还提供一种改善剂，其是以单链核酸结合蛋白为有效成分的多重RT－PCR的产量改善剂，该单链核酸结合蛋白为T4GP32或其变异体，并且添加在逆转录和多重PCR双方的反应液中。
具体实施方式
[0013]关于本说明书中所引用的全部专利文献、非专利文献和其他出版物，其全部在本说明书中作为参考而被引用。
[0014]在本说明书中，关于氨基酸序列或核苷酸序列的“至少90％的同一性”是指90％以上、优选95％以上、更优选97％以上、进一步优选98％以上、进一步优选99％以上的同一性。
[0015]在本说明书中，核苷酸序列和氨基酸序列的同一性可以利用Lipman－Pearson法(Science，1985，227：1435－41)进行计算。具体而言，可以利用遗传信息处理软件Genetyx－Win(Ver.5.1.1；软件开发)的同源性分析(Search homology)程序，将Unit size to compare(ktup)设为2进行分析而算出。
[0016]因为期待提高多重RT－PCR的灵敏度和产量。本专利技术涉及一种高灵敏度且高产量的利用RNA的核酸扩增方法。
[0017]本专利技术的专利技术人发现，通过在T4GP32的存在下进行多重RT－PCR中的RT和PCR双方的反应，即使利用微量的RNA样本，也能够实现高产量。
[0018]本专利技术能够提高多重RT－PCR的灵敏度和产量。本专利技术的方法能够进行对来自SSL的RNA这样的微量RNA样本进行高效扩增和分析。本专利技术能够提高使用RNA试样的分析(例如基因分析、诊断等)的灵敏度和精度以及效率。
[0019]本专利技术提供一种利用RNA的核酸扩增方法。该方法包括通过逆转录由样本RNA合成cDNA的步骤和利用多重PCR扩增该cDNA的步骤。
[0020]本专利技术的方法所使用的样本RNA可以为任何种类的RNA，例如可以列举来自动物、植物、微生物、病毒等的RNA。该样本RNA可以包含mRNA、tRNA、rRNA、小分子RNA(small RNA)(例如微RNA(microRNA(miRNA))、小干扰RNA(small interfering RNA(siRNA))、Piwi相互作用RNA(Piwi－interacting RNA(piRNA))等)、长链基因间非编码RNA(long intergenic non－coding(linc)RNA)等。该样本RNA可以包含上述RNA的1种或2种以上。
[0021]该样本RNA可以利用通常的方法从动物、植物、微生物、病毒等中提取。例如，该RNA的提取可以使用酚－氯仿(Phenol/chloroform)法、酸性硫氰酸胍－酚－氯仿提取(AGPC、acid guanidinium thiocyanate－phenol－chloroform extraction)法或它们的变形方法、使用涂布有二氧化硅的特殊的磁体颗粒的方法、使用固相载体可逆化固定(Solid Phase Reversible Immobilization)磁体颗粒的方法、或者市售的RNA精制用试剂(例如TRIzol(注册商标)Reagent、RNeasy(注册商标)、QIAzol(注册商标)、ISOGEN等)等。
[0022]在优选的一个实施方式中，该样本RNA为来自皮肤表面脂质的RNA。在本说明书中，“皮肤表面脂质(skin surface lipids；SSL)”是指存在于皮肤表面上的脂溶性成分，有时也称为皮脂。一般而言，SSL主要含有由位于皮肤的皮脂腺等外分泌腺分泌的分泌物，以覆盖皮肤表面的薄层的形式存在于皮肤表面上。SSL中含有来自被检测体的皮肤细胞的RNA，能够利用其对生物体进行分析(专利文献1)。
[0023]提取来自该SSL的RNA的被检测体只要是皮肤上具有SSL的生物即可。作为被检测体的例子，可以列举包括人和非人哺乳动物在内的哺乳动物，优选为人。例如，该被检测体可以为需要进行自身的核酸分析的人或非人哺乳动物。或者，该被检测体可以为需要或希望进行皮肤的基因表达分析、或者使用核酸的皮肤或皮肤以外的部位的状态分析的人或非人哺乳动物。
[0024]作为采集被检测体的SSL的皮肤的部位，可以列举头、脸、颈、躯干、手足等身体的任意部位的皮肤、患有特应性炎症、痤疮、干燥症、炎症(发红)、肿瘤等疾病的皮肤、有创伤的皮肤等，但没有特别限定。在本说明书中，只要没有特别限定，“皮肤”是包括体表的表皮、
真皮、毛囊，以及汗腺、皮脂腺和其他腺体等组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸扩增的方法，其特征在于，包括：通过逆转录由样本RNA合成cDNA的步骤；和利用多重PCR扩增该cDNA的步骤，该逆转录和该多重PCR在单链核酸结合蛋白的存在下进行，该单链核酸结合蛋白为T4GP32或其变异体。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述T4GP32或其变异体为由序列号1的氨基酸序列或与该序列至少90％序列相同的氨基酸序列构成并且与单链核酸结合的蛋白质。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述逆转录反应在含有随机引物的反应液中进行。4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于：所述样本RNA为来自皮肤表面脂质的RNA。5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于：所述逆转录和所述多重PCR的反应液中的所述单链核酸结合蛋白的初始浓度为1～100μg/mL。6.一种改善剂，其特征在于：其是以单链核酸结合蛋白为有效成分的多重RT－PCR的产量改善剂，该单链核酸结合蛋白为T4GP32或其变异体，并且添加在逆转录和多重PCR双方的反应液中。7.如权利要求6所述的改善剂，其特征在于：所述T4GP32或其变异体为由序列号1的氨基酸序列或与该序列至少90％序列相同的氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：上原裕也，井上高良，
申请(专利权)人：花王株式会社，
类型：发明
国别省市：