基于单细胞阵列的纳米电穿孔装置及其应用制造方法及图纸

本公开提供了一种基于单细胞阵列的纳米电穿孔装置及其应用，用于从活细胞内提取带电物质和/或向活细胞内递送带电物质，该纳米电穿孔装置包括一单细胞可寻址微孔阵列、一纳米通孔聚合物薄膜、一储存室、一顶电极和一底电极。与传统的电穿孔方法相比，本公开采用的纳米电穿孔施加的电压小于50伏，电压大幅度降低，能够在维持细胞良好活性的前提下，同时具有单细胞精度、高效、安全、高通量和均一性高的优势。优势。优势。

【技术实现步骤摘要】
基于单细胞阵列的纳米电穿孔装置及其应用
[0001]本申请是分案申请，母案的申请号：202011093674.2，申请日：2020年10月13日，名称：基于单细胞阵列的纳米电穿孔装置及其应用。


[0002]本公开涉及细胞生物分析
，更具体地，涉及一种基于单细胞阵列的纳米电穿孔装置及应用其进行生物分子输送的方法。

技术介绍

[0003]肿瘤细胞广泛存在细胞异质性，这是造成肿瘤治疗过程中产生耐药细胞亚型的主要原因，并与肿瘤转移具有密切的相关性。单细胞分析技术是研究细胞异质性的有效手段。目前，传统的生物技术，如PCR，Western blotting等，往往需要从大量细胞中进行标志物的提取和分析，无法精准地反映出单细胞水平上的异质性，并且容易造成分析结果不完善。近年来发展的单细胞分析技术，将传统方法与微纳米芯片相结合，虽然能在单细胞水平上进行基因组和蛋白组等的分析，但均无法保证细胞的活性，且操作步骤复杂，重复性差。
[0004]细胞原位分析技术可以提供细胞标志物的信息，并可以对细胞状态进行实时的观察，进而能够获得丰富的细胞行为学信息。尤其是还能在单细胞水平上，对细胞的异质性进行直观地比较。在单细胞原位分析中，往往需要将外源的功能分子递送至细胞内，或者将细胞内的物质提取至细胞外，再进行分析。目前的递送技术可分为病毒载体、化学方法和物理方法。
[0005]病毒载体，例如腺病毒、慢病毒等，在递送效率方面具有较高的优势。但是由于病毒自身基因片段也可能被导入宿主染色体中，因此，在基因检测方面的应用受到限制。
[0006]化学方法主要是将人工合成的微纳米材料作为载体，通过细胞的内吞作用和外排作用，实现生物分子的输送。对于分子量较小的生物分子，例如siRNAs，化学方法具有较高的递送效率。但是，对于大分子量的生物分子，例如CRISPR
‑
Cas9质粒(>9kbs)，其递送效率非常有限。
[0007]物理方法递送的主要原理是在细胞膜上施加物理场，例如电场、磁场等，使细胞膜瞬间产生可逆的通道，同时细胞周围溶液中的外源分子，如DNA、RNA、药物等在物理场的作用下发生转移，进而可以实现功能分子的递送。
[0008]其中，电穿孔技术作为一种简单直接的物理输送工具，已被广泛地用于生物医学研究，包括再生医学，过继免疫疗法和在体基因编辑等。与显微注射，声纳穿孔和渗透作用等其他物理方法相比，电穿孔方法更加容易操作且更具普适性。
[0009]但是，在传统的电穿孔装置中，细胞需要承受上百伏的高压，极易造成细胞损伤甚至死亡，不利于对细胞进行后续的基因分析。另外，在不同的细胞类型，待递送物和缓冲溶液的条件下，传递的效率对于每个细胞来说并不一致，这对细胞异质性的分析造成了阻碍。

技术实现思路

[0010]为解决现有技术中存在的上述问题，本公开实施例提出一种基于单细胞阵列的纳米电穿孔装置及应用其从活细胞内提取带电物质和/或向活细胞内递送带电物质的方法，以精确地对单细胞进行操控和电穿孔，生物分子的输送，细胞内分子的检测，以及细胞的高通量筛选，从而实现大量单细胞的同时原位分析。
[0011]本公开的一个方面提供了一种基于单细胞阵列的纳米电穿孔装置，用于从活细胞内提取带电物质和/或向活细胞内递送带电物质，该纳米电穿孔装置包括一单细胞可寻址微孔阵列、一纳米通孔聚合物薄膜、一储存室、一顶电极和一底电极，其中：
[0012]所述单细胞可寻址微孔阵列，用于阵列化承载的单细胞，并提供每个单细胞在阵列上的位置信息；
[0013]所述纳米通孔聚合物薄膜，紧密贴合于所述单细胞可寻址微孔阵列之下，用于聚焦电场进行细胞膜电穿孔；
[0014]所述储存室，位于所述纳米通孔聚合物薄膜之下，连通于所述单细胞可寻址微孔阵列，用于存放从活细胞内提取出的带电物质，存放将要递送至活细胞内的带电物质，以及收集细胞分泌的外泌体、蛋白质；
[0015]所述顶电极，位于所述单细胞可寻址微孔阵列之上，用于电穿孔时形成回路；
[0016]所述底电极，位于所述储存室下方，用于电穿孔时形成回路；
[0017]其中，所述顶电极和所述底电极为纳米电穿孔提供工作电压，同时产生电场力驱动顶电极与底电极之间的带电物质，完成带电物质从活细胞内向储存室移动，或者完成带电物质从储存室向活细胞内移动。
[0018]在本公开的一个实施例中，所述带电物质至少包括核酸、蛋白质、神经递质、药物、染料在内的尺寸为纳米尺度的物质。
[0019]在本公开的一个实施例中，所述单细胞可寻址微孔阵列由尺寸为直径10
‑
50微米、深度5
‑
20微米的微孔以间隔D为10
‑
100微米的边缘距离组成的10
×
10个的小阵列，再由10
×
10个的小阵列以间隔为2
×
D的距离组成10
×
10至1000
×
1000个的大阵列，以小阵列为基准对每个小阵列进行序号标记，以识别每个微孔的位置。
[0020]在本公开的一个实施例中，所述纳米通孔聚合物薄膜由重离子径迹蚀刻聚碳酸酯薄膜或者聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜制备得到，并与所述单细胞可寻址微孔阵列的底部紧密贴合。
[0021]在本公开的一个实施例中，所述储存室位于所述纳米通孔聚合物薄膜下方，并通过所述纳米通孔聚合物薄膜与所述单细胞可寻址微孔阵列相连通。
[0022]在本公开的一个实施例中，所述顶电极和所述底电极连接于方波脉冲电压，电压10
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50V，脉冲个数10
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300个，脉冲持续时间0.1
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1秒，脉冲间隔0.1
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100毫秒。
[0023]本公开的另一方面提供了一种应用所述的基于单细胞阵列的纳米电穿孔装置进行带电物质提取的方法，当该方法用于从活细胞内提取带电物质时，具体包括：大量活细胞被均匀加载于所述单细胞可寻址微孔阵列之上，待细胞与紧密贴合于所述单细胞可寻址微孔阵列之下的纳米通孔聚合物薄膜中的纳米孔紧密接触，通过所述顶电极和所述底电极施加脉冲电压，使细胞膜上瞬间形成微通道，同时产生电泳力，将细胞内的带电物质通过所述纳米通孔聚合物薄膜输送到所述储存室内。
[0024]本公开的再一方面提供了一种应用所述的基于单细胞阵列的纳米电穿孔装置进行带电物质递送的方法，当该方法用于向活细胞内递送带电物质时，具体包括：大量活细胞被均匀加载于所述单细胞可寻址微孔阵列之上，待细胞与紧密贴合于所述单细胞可寻址微孔阵列之下的纳米通孔聚合物薄膜中的纳米孔紧密接触，通过所述顶电极和所述底电极施加脉冲电压，使细胞膜上瞬间形成微通道，同时产生电泳力，将所述储存室内作为待送物的带电物质通过所述纳米通孔聚合物薄膜递送到细胞内。
[0025]在本公开的一个实施例中，该方法采用细胞自行贴壁，或者借助磁力、电场力、光镊、离心力、重力、流体力在内的可操控细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于单细胞阵列的纳米电穿孔装置，用于从活细胞内提取带电物质和/或向活细胞内递送带电物质，该纳米电穿孔装置包括一单细胞可寻址微孔阵列、一纳米通孔聚合物薄膜、一储存室、一顶电极和一底电极，其特征在于：所述单细胞可寻址微孔阵列，用于阵列化承载的单细胞，并提供每个单细胞在阵列上的位置信息；所述纳米通孔聚合物薄膜，紧密贴合于所述单细胞可寻址微孔阵列之下，用于聚焦电场进行细胞膜电穿孔；所述储存室，位于所述纳米通孔聚合物薄膜之下，连通于所述单细胞可寻址微孔阵列，用于存放从活细胞内提取出的带电物质，存放将要递送至活细胞内的带电物质，以及收集细胞分泌的外泌体、蛋白质；所述顶电极，位于所述单细胞可寻址微孔阵列之上，用于电穿孔时形成回路；所述底电极，位于所述储存室下方，用于电穿孔时形成回路；其中，所述顶电极和所述底电极为纳米电穿孔提供工作电压，同时产生电场力驱动顶电极与底电极之间的带电物质，完成带电物质从活细胞内向储存室移动，或者完成带电物质从储存室向活细胞内移动。2.根据权利要求1所述的基于单细胞阵列的纳米电穿孔装置，其特征在于，所述带电物质至少包括核酸、蛋白质、神经递质、药物、染料在内的尺寸为纳米尺度的物质。3.根据权利要求1所述的基于单细胞阵列的纳米电穿孔装置，其特征在于，所述单细胞可寻址微孔阵列由尺寸为直径10
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50微米、深度5
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20微米的微孔以间隔D为10
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100微米的边缘距离组成的10
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10个的小阵列，再由10
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10个的小阵列以间隔为2
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D的距离组成10
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10至1000
×
1000个的大阵列，以小阵列为基准对每个小阵列进行序号标记，以识别每个微孔的位置。4.根据权利要求1所述的基于单细胞阵列的纳米电穿孔装置，其特征在于，所述纳米通孔聚合物薄膜由重离子径迹蚀刻聚碳酸酯薄膜或者聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜制备得到，并与所述单细胞可寻址微孔阵列的底部紧密...

【专利技术属性】
技术研发人员：常凌乾，董再再，
申请(专利权)人：北京航空航天大学，
类型：发明
国别省市：