一种检测KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因突变的引物探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因突变的引物探针组合及其应用。所述引物探针组合包括检测KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因突变的引物和探针。本发明专利技术设计检测KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因突变的引物探针组合，利用数字PCR对肿瘤中KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因的14种热点突变进行定性检测，具备良好特异性和灵敏度，且操作简便、成本低。成本低。成本低。

【技术实现步骤摘要】
一种检测KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因突变的引物探针组合及其应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，涉及一种检测KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因突变的引物探针组合及其应用。

技术介绍

[0002]KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因在EGFR信号传导通路下游RAS
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RAF
‑
MEK
‑
ERK途径和PI3K
‑
AKT
‑
mTOR途径中起到分子关卡的作用，与肿瘤的发生发展息息相关。KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因的突变会直接影响针对EGFR基因的抗肿瘤药物的疗效，进行癌症患者基因突变状态的检测与分析，对临床用药及治疗方案指导具有重要意义。
[0003]目前检测KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因突变的方法主要有2种：荧光定量PCR法和测序法。直接测序法存在检测灵敏度不足、操作繁琐、无法进行多突变同时检测等缺点。大部分商用的试剂盒依赖于ARMS
‑
qPCR技术，在针对多点突变联合检测时，但只能进行定性分析，并且在单管体系内无法区分突变亚型，如CN106636442A公开了一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒，包括以下部分：EGFR基因引物组、KRAS基因引物组、BRAF基因引物组、NRAS基因引物组、PIK3CA基因引物组、HiFi酶、PCR反应液、消化酶、连接酶、连接缓冲液、连接接头、荧光探针、QPCR反应的Taq酶、QPCR引物和QPCR反应液，能同时检测人类肿瘤的多种驱动基因的突变位点，包括EGFR、NRAS、KRAS、PIK3CA和BRAF中一个或多个基因突变位点。商用的基于数字PCR技术的基因突变检测试剂盒同样无法在多位点突变检测中区分突变亚型，而只针对两三个热点突变的检测方案虽然能够确定突变亚型，但却无法满足临床对多突变检测实际需求。
[0004]综上所述，提供一种检测KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因中多个突变热点试剂盒，对于肿瘤基因检测领域具有重要意义。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种检测KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因突变的引物探针组合及其应用，设计特定序列的引物探针组合，协同配合，可基于数字PCR，能够同时检测KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因的14种热点突变，具备良好特异性和灵敏度，且操作简便、成本低。
[0006]为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种检测KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因突变的引物探针组合，所述引物探针组合包括检测KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因的引物和探针；所述KRAS基因的引物包括3对引物，核酸序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的序列；所述KRAS基因的野生型探针的核酸序列包括SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9所示的序列；所述KRAS基因的参考探针的核酸序列包括SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.11所示的序列；所述NRAS基因的引物包括2对引物，核酸序列包括SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.15所示的序列；所述NRAS基因的野
生型探针的核酸序列包括SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的序列；所述NRAS基因的参考探针的核酸序列包括SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示的序列；所述BRAF基因的引物包括1对引物，核酸序列包括SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示的序列；所述BRAF基因的野生型探针的核酸序列包括SEQ ID NO.22；所述BRAF基因的参考探针的核酸序列包括SEQ ID NO.23；所述PIK3CA基因的引物包括1对引物，核酸序列包括SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示的序列；所述PIK3CA基因的野生型探针的核酸序列包括SEQ ID NO.26；所述PIK3CA基因的参考探针的核酸序列包括SEQ ID NO.27。
[0008]本专利技术中，针对KRAS基因不同的外显子(Exon2、Exon3、Exon4)，NRAS基因两个外显子(Exon2、Exon3)、BRAF基因以及PIK3CA基因设计引物、野生型探针及参考探针，协同配合并能够基于数字PCR同时检测KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因的14种热点突变，包括KRAS突变基因p.G12S、p.G12D、p.G12C、p.G12V、p.G12A、p.G13D、p.Q61H、p.K117N(19940)、p.K117N(28519)；NRAS突变基因p.G12D、p.Q61R、p.Q61K；BRAF突变基因p.V600E；PIK3CA突变基因p.H1047R，不同外显子的靶标分别记为KRAS
‑
E2、KRAS
‑
E3、KRAS
‑
E4、NRAS
‑
E2和NRAS
‑
E3。
[0009]KRAS
‑
E2正向引物(SEQ ID NO.1)：5
’‑
AAGGCCTGCTGAAAATGACT
‑3’
。
[0010]KRAS
‑
E2反向引物(SEQ ID NO.2)：5
’‑
GTCCTGCACCAGTAATATGC
‑3’
。
[0011]KRAS
‑
E3正向引物(SEQ ID NO.3)：5
’‑
TCTCCCTTCTCAGGATTCCT
‑3’
。
[0012]KRAS
‑
E3反向引物(SEQ ID NO.4)：5
’‑
TACACAAAGAAAGCCCTCCC
‑3’
。
[0013]KRAS
‑
E4正向引物(SEQ ID NO.5)：
[0014]5’‑
GGACTCTGAAGATGTACCTATGG
‑3’
。
[0015]KRAS
‑
E4反向引物(SEQ ID NO.6)：
[0016]5’‑
TCAGTGTTACTTACCTGTCTTGT
‑3’
。
[0017]NRAS
‑
E2正向引物(SEQ ID NO.12)：5
’‑
GGTTTCCAACAGGTTCTTGC
‑3’
。
[0018]NRAS
‑
E2反向引物(SEQ ID NO.13)：5
’‑
ACTGGGCCTCACCTCTATG
‑3’
。
[0019]NRAS
‑
E3正向引物(SEQ ID本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因突变的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括检测KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因的引物和探针；所述KRAS基因的引物包括3对引物，核酸序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的序列；所述KRAS基因的野生型探针的核酸序列包括SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9所示的序列；所述KRAS基因的参考探针的核酸序列包括SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.11所示的序列；所述NRAS基因的引物包括2对引物，核酸序列包括SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.15所示的序列；所述NRAS基因的野生型探针的核酸序列包括SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的序列；所述NRAS基因的参考探针的核酸序列包括SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示的序列；所述BRAF基因的引物包括1对引物，核酸序列包括SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示的序列；所述BRAF基因的野生型探针的核酸序列包括SEQ ID NO.22；所述BRAF基因的参考探针的核酸序列包括SEQ ID NO.23；所述PIK3CA基因的引物包括1对引物，核酸序列包括SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示的序列；所述PIK3CA基因的野生型探针的核酸序列包括SEQ ID NO.26；所述PIK3CA基因的参考探针的核酸序列包括SEQ ID NO.27。2.根据权利要求1所述的检测KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因突变的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5
’
端标记有荧光基团，3
’
端标记有淬灭基团；优选地，所述荧光基团包括FAM、VIC、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、CY5或Texas Red；优选地，所述淬灭基团包括MGB、TAMRA、DABCYL、BHQ
‑
1、BHQ
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2、BHQ
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3或Eclipse。3.权利要求1或2所述的检测KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因突变的引物探针组合在制备检测KR...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雯雯，陈永欣，王纪东，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：