一种稳定表达Luciferase的他莫昔芬耐药细胞株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种稳定表达Luciferase的他莫昔芬耐药细胞株及其构建方法和应用，通过将稳定表达荧光素酶基因的肿瘤细胞进行裸鼠原位异种移植成瘤实验，裸鼠成瘤后，注射他莫昔芬治疗，治疗结束后，取出治疗压力下稳定增殖的肿瘤块，进行原代培养，得到他莫昔芬耐药细胞株。本发明专利技术还公开一种他莫昔芬耐药细胞株CS

【技术实现步骤摘要】
一种稳定表达Luciferase的他莫昔芬耐药细胞株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于肿瘤生物学和肿瘤治疗学
，具体涉及一种稳定表达Luciferase的他莫昔芬耐药细胞株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]乳腺癌是目前发病率和死亡率最高的妇科恶性肿瘤，且于2020年发病率首次取代肺癌成为全球第一大癌症，占所有新增癌症患者的11.7％，其中超过50％的乳腺癌患者雌激素受体阳性，该类乳腺癌的治疗也成为人们关注的焦点。传统的化疗和放疗由于缺乏特异性，取得疗效的同时也往往给患者带来较大的毒副作用。因此，针对不同分子遗传学背景的群体或/和个体，根据其分子特点进行有选择性的“个体化”治疗，以使疗效达到最优化，毒性最低化。内分泌治疗在雌激素受体阳性患者的临床治疗中成为主流疗法，且表现出了良好的疗效，有力改善患者临床结局，但大部分患者在接受内分泌治疗肿瘤消退后的5年甚至更长时间后出现复发，且针对此类晚期乳腺癌患者，他莫昔芬作为其主流临床的内分泌药物，在改善患者预后方面非常有限，这类患者通常即使服用药物，生存期也只有1
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2年，临床结局不佳。他莫昔芬耐药是雌激素受体阳性乳腺癌临床治疗的一大挑战。
[0003]目前国内尚无模拟临床体内构建的他莫昔芬耐药细胞株，仅有的耐药模型并未模拟临床进行耐药方向的建模，且细胞株产生多药耐药，致使耐药机制复杂，影响因素过多，不利于对单一药物引起的肿瘤耐药及转移的研究。
[0004]随着肿瘤研究的深入，应用传统方法(如卡尺测量肿瘤体积、肿瘤组织切片等)进行肿瘤研究已存在诸多限制。如进行组织切片观测前需要处死小鼠取出肿瘤组织，因此，在不同时间点或不同实验组都需要处死一批实验小鼠以获取足够的统计学数据，这样不但大大增加了实验成本，而且很难消除由于小鼠个体差异而产生的误差，无法获取可靠的重复性数据，在制作切片时也无法保证实验的准确性。另外，微小转移灶也很难被传统手段检测到。
[0005]荧光素酶(Luciferase)是一类产生生物发光的氧化酶，可以在实验室中通过基因工程生产，并被用于多种目的，荧光素酶基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中。在萤光素酶反应中，当萤光素酶作用于合适的萤光素底物时会发光，而发出的光子可以通过光敏设备，如光度计或改进的光学显微镜检测，这就使得对于生物过程观察成为可能。由于荧光素酶生物发光不需要光激发，因此自发荧光很小，因此几乎没有背景荧光。表达荧光素酶的细胞移植到动物身上时，可进行全动物体内活体成像，是研究活体动物(如小鼠)细胞群的强大技术。这种技术已被应用于动物模型中跟踪肿瘤发生和肿瘤对治疗的反应，尤其对微小转移灶具有更高敏感性。

技术实现思路

[0006]本专利技术为了解决现有技术中的不足和缺点，提出一种他莫昔芬耐药细胞株及其构
建方法和应用。本专利技术通过使用表达Luciferase的载体质粒转染MCF7细胞系并进行稳定筛选，以表达此载体的MCF7细胞系构建小鼠来源的细胞他莫昔芬耐药模型，可稳定标记与活体示踪，用于后期他莫昔芬治疗压力下耐药转移等方向的深入研究，为开发内分泌治疗耐受的雌激素受体阳性乳腺癌患者的新治疗策略提供参考。本专利技术模拟雌激素受体阳性乳腺癌患者主要内分泌药物他莫昔芬的临床给药，创新性地从体内构建他莫昔芬耐药模型。
[0007]本专利技术的具体技术方案如下：
[0008]本专利技术第一方面提供一种稳定表达Luciferase的他莫昔芬耐药细胞株的构建方法，包括如下步骤：
[0009](1)转染表达荧光素酶基因的载体进入MCF7细胞，筛选稳定表达荧光素酶基因的MCF7细胞；
[0010](2)将步骤(1)所述稳定表达荧光素酶基因的MCF7细胞进行裸鼠原位异种移植成瘤实验，肿瘤大小超过100mm3时，注射不断增大剂量的他莫昔芬治疗，肿瘤在治疗期间形成持续增殖的肿瘤块，取出该肿瘤块原代培养，获得的细胞即为稳定表达Luciferase的他莫昔芬耐药细胞。
[0011]进一步地，步骤(2)中，当裸鼠成瘤后肿瘤大小超过100mm3时，依次分别按照5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg，50mg/kg剂量腹腔注射给予他莫昔芬治疗各1周，此后以50mg/kg剂量腹腔注射给予他莫昔芬治疗6周。
[0012]本专利技术第二方面提供上述构建方法构建获得的稳定表达Luciferase的他莫昔芬耐药细胞株。
[0013]本专利技术第三方面提供一种稳定表达Luciferase的他莫昔芬耐药细胞株，其分类命名为人源雌激素受体阳性乳腺癌细胞CS
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MCF7
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TR，保藏编号为CCTCC NO:C2022118。
[0014]本专利技术第四方面提供所述稳定表达Luciferase的他莫昔芬耐药细胞株作为肿瘤耐药或转移机制研究的细胞模型的应用。
[0015]本专利技术第五方面提供所述稳定表达Luciferase的他莫昔芬耐药细胞株作为肿瘤靶向治疗位点筛选细胞模型的应用。
[0016]本专利技术第六方面提供所述稳定表达Luciferase的他莫昔芬耐药细胞株作为肿瘤靶向治疗药物筛选细胞模型的应用。
[0017]上述的应用中，所述肿瘤为晚期雌激素受体阳性乳腺癌。
[0018]进一步地，所述稳定表达Luciferase的他莫昔芬耐药细胞株作为他莫昔芬耐药肿瘤的靶向治疗位点筛选细胞模型的应用。
[0019]进一步地，所述稳定表达Luciferase的他莫昔芬耐药细胞株作为他莫昔芬耐药肿瘤的靶向治疗药物筛选细胞模型的应用。
[0020]本专利技术的有益效果为：
[0021]1、本专利技术提供的他莫昔芬耐药细胞株的体内构建方法，通过生物学手段，转染表达荧光素酶基因的载体进入肿瘤细胞，筛选稳定表达荧光素酶基因的肿瘤细胞进行裸鼠原位异种移植成瘤实验，裸鼠成瘤后，注射肿瘤内分泌治疗药物他莫昔芬治疗。治疗结束后，取出稳定增殖的肿瘤块，进行原代培养，验证细胞他莫昔芬耐受特性，得到他莫昔芬耐药细胞株。一方面，该构建方法模拟雌激素受体阳性乳腺癌患者主要内分泌药物他莫昔芬的临床给药，创新性地从体内构建他莫昔芬耐药细胞模型，克服了当前从人体直接分离雌激素
受体阳性乳癌病灶组织难以在小鼠体内成瘤建模的问题；且该构建方法可以针对单一药物引起的肿瘤耐药及转移进行研究，专一性强；另一方面，细胞内稳定表达的荧光素酶可稳定标记与活体示踪，尤其对微小转移灶具有更高敏感性，便于后期他莫昔芬治疗压力下复发转移等方向的深入研究，为开发晚期雌激素受体阳性乳腺癌患者的新治疗策略提供参考。
[0022]2、本专利技术提供的体内构建的他莫昔芬耐药细胞株CS
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MCF7
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TR，相对于亲本细胞的他莫昔芬耐受性明显增强。一方面，建模过程和临床给药高度贴合，有利于研发雌激素受体阳性乳腺癌晚期患者内分泌治疗抵抗的临床肿瘤转移和耐药的分子机制，进行相关生物学研究和挖掘新的治疗策略，期望有效改善晚期雌激素受体阳性乳腺癌患者的预后和临床结局。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种稳定表达Luciferase的他莫昔芬耐药细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)转染表达荧光素酶基因的载体进入MCF7细胞，筛选稳定表达荧光素酶基因的MCF7细胞；(2)将步骤(1)所述稳定表达荧光素酶基因的MCF7细胞进行裸鼠原位异种移植成瘤实验，肿瘤大小超过100mm3时，注射不断增大剂量的他莫昔芬治疗，肿瘤在治疗期间形成持续增殖的肿瘤块，取出该肿瘤块原代培养，获得的细胞即为稳定表达Luciferase的他莫昔芬耐药细胞。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，当裸鼠成瘤后肿瘤大小超过100mm3时，依次分别按照5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg，50mg/kg剂量腹腔注射给予他莫昔芬治疗各1周，此后以50mg/kg剂量腹腔注射给予他莫昔芬治疗6周。3.权利要求1或2所述构建方法构建获得的稳定表达Luciferase的他莫昔芬耐药细胞株。4.一种稳定表达Luciferase的他莫昔芬耐药细胞株，其特征在于，其分类命名为人源雌激素受体阳性乳腺癌细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈淑，罗贝，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：