快速获得田间小型害虫和害螨抗性分子标记的方法技术

本发明专利技术公开了快速获得田间小型害虫和害螨抗性分子标记的方法，包括如下步骤：步骤1：采集田间小型害虫或害螨种群，用供试杀虫(螨)剂进行生物测定，确定敏感基线；步骤2：根据敏感基线，用80％的致死浓度(LC

【技术实现步骤摘要】
快速获得田间小型害虫和害螨抗性分子标记的方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，尤其提出一种快速获得田间小型害虫和害螨抗性分子标记的方法。

技术介绍

[0002]化学防治是农业害虫(螨)防控的主要方式，但其有效性受到害虫(螨)抗性发展迅速的严峻挑战。目前，害虫(螨)抗性监测分子标记的开发主要借助于已发现的抗性靶标突变位点，但长期的田间实际应用发现，这种单一的分子标记开发策略存在明显的缺陷：其一，基因突变本具有稀有性，杀虫(螨)剂靶标突变的发现常要借助室内高抗品系的筛选培养或田间高抗种群的采集，耗时长久，往往存在分子标记尚未得到开发而药剂本身已面临市场淘汰的困境。其二，靶标突变作为分子标记难以实现抗药性的早期监测，因为田间一旦检测到靶标突变，意味着害虫(螨)已经产生了较高的抗药性。其三，有大量研究表明田间害虫(螨)种群抗药性产生的初期，解毒酶活性的升高是常见的现象，而且一些害虫(螨)种群无靶标突变的情况下，仍会对农药产生高抗性。因此，抗药性相关解毒酶基因可开发为分子标记以解决单用靶标突变来监测抗药性所面临的困境。但如何快速、准确获得大量害虫(螨)抗药性相关的解毒酶基因(抗性分子标记)，以实现抗药性早期监测的方法仍不清楚。

技术实现思路

[0003]1.要解决的技术问题
[0004]本专利技术的目的是为了解决现有技术中缺少快速、准确的获得大量抗性分子标记，无法实现对田间害虫(螨)抗药性早期监测的问题，而提出的快速获得田间小型害虫和害螨抗性分子标记的方法。
[0005]2.技术方案
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0007]快速获得田间小型害虫和害螨抗性分子标记的方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1：采集田间小型害虫或害螨种群，用供试杀虫(螨)剂进行生物测定，确定敏感基线；
[0009]田间采集害虫(螨)种群约2000头，用叶碟将其在恒温光照培养箱中饲养，用丙酮将待测杀虫(螨)剂原药先配成母液，然后用0.1％吐温80水溶液将其稀释至5个梯度浓度，挑取待测害虫(螨)30头于新鲜叶碟中，用potter喷雾塔对叶碟喷施药剂1mL，每个浓度喷施3个叶碟，将受药叶碟放于恒温光照培养箱中培养24h，用体式显微镜观测害虫(螨)受药反应情况，记录死亡数，计算生物测定数据，获得敏感基线；
[0010]步骤2：根据敏感基线，用80％的致死浓度(LC
80
)对害虫(螨)种群进行1代筛选，提取亲本和F1代害虫(螨)总RNA并进行转录组测序；
[0011]依据敏感基线，用清水将待测杀虫(螨)剂制剂稀释至LC
80
浓度，将1000头害虫(螨)转移至新鲜叶碟中，每个叶碟100头，用potter喷雾塔对叶碟喷施药剂1mL，将受药叶碟放于
恒温光照培养箱中培养24h，将存活的害虫(螨)挑入新鲜叶碟，待其产卵2d后移除，继续培养卵发育至成虫(螨)阶段，得到F1代；
[0012]挑取亲本与F1代害虫(螨)约200头于1.5mL无酶离心管中，液氮速冻后，加入500μL Trizol，充分匀浆，向匀浆液中加入100μL氯仿，离心管放入高速冷冻离心机，12000rpm、4℃离心10min，将上清液小心转入新的无酶离心管中，加入异丙醇，将离心管放入高速冷冻离心机，12000rpm、4℃离心10min，弃去上清，沉淀用冰冷的75％乙醇洗一次；离心管放入冷冻离心机，8000rpm、4℃离心5min，弃上清，沉淀室温干燥3
‑
5min，待其即将变透明时加入30μL无酶水进行溶解，吸取所得RNA溶液5μL，其中2μL用于测浓度，3μL用于电泳检测其完整性，剩余25μL放入
‑
80℃冰箱备用；
[0013]RNA样品首先采用epicentre Ribo
‑
Zero
TM
去除核糖体RNA(rRNA)，随后利用Fragmentation Buffer将RNA碎片化；以打碎的RNA片段为模板，用random hexamers引物合成cDNA第一链，最后通过PCR法富集纯化cDNA文库；
[0014]对双链cDNA文库测序得到双末端reads(Paired
‑
end reads)的原始数据(raw data)后，使用perl脚本对原始数据进行优化，得到clean data，然后计算评估clean data的Q30、GC含量等质控指标；
[0015]步骤3：以亲本为对照，分析筛选F1代害虫(螨)中上调表达的解毒酶基因，即获得抗性分子标记；
[0016]所得原始clean reads用Tophat2软件将其与参考基因组序列比对分析，并组装转录本映射到参考基因组注释信息进行比较，得出已知功能注释基因和未经注释的新基因，获得基因的注释信息，随后采用DESeq软件将F1代基因的表达量与亲本进行比较，筛选出上调表达的解毒酶基因，即抗性分子标记。
[0017]优选地，所述步骤1中用SPSS 22.0计算生物测定数据。
[0018]优选地，所述步骤2中氯仿上下剧烈摇晃15s，室温平衡5min。
[0019]优选地，所述步骤2中加入300μL异丙醇，上下颠倒30次，
‑
20℃放置20min。
[0020]优选地，所述步骤2中以游离的dATP、dUTP、dCTP、dGTP四种碱基为原料，利用RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二链，使用磁珠法(AMPure XP beads)纯化cDNA；对所得双链cDNA进行末端修复，3
’
端加入碱基“A”，然后用AMPure XP beads筛选片段，用特异性酶降解含碱基“U”的cDNA第一链。
[0021]优选地，所述步骤2中采用Illumina Novaseq 6000测序平台对双链cDNA文库测序。
[0022]优选地，所述步骤3中通过BLASTX软件将所有基因序列与Nt、GO、Swiss
‑
Port、NR、KEGG、COG和KOG数据库序列信息进行比对，获得基因的注释信息。
[0023]3.有益效果
[0024]相比于现有技术，本专利技术的优点在于：
[0025](1)快速且准确：本专利技术中，通过采集田间害虫(螨)种群，无需耗时长久的抗性品系培养过程，只用高剂量杀虫(螨)剂筛选1代，进行转录组测序分析即可获得大量的抗性分子标记，速度快、准确性高。
[0026](2)成本低：本专利技术中，所涉及转录组测序成本低，且针对特定的害虫(螨)及农药只需要1次测序即可大量获得抗性分子标记。
[0027](3)方法简单：本专利技术中，所涉及的技术方法均已成熟，且操作简便，在绝大多数实验室均可完成。
附图说明
[0028]图1为朱砂叶螨丁氟螨酯抗性品系(YN
‑
CyR)三个抗性阶段上调表达基因的维恩图和表达趋势分析；
[0029]A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.快速获得田间小型害虫和害螨抗性分子标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：采集田间小型害虫或害螨种群，用供试杀虫(螨)剂进行生物测定，确定敏感基线；田间采集害虫(螨)种群约2000头，用叶碟将其在恒温光照培养箱中饲养，用丙酮将待测杀虫(螨)剂原药先配成母液，然后用0.1％吐温80水溶液将其稀释至5个梯度浓度，挑取待测害虫(螨)30头于新鲜叶碟中，用potter喷雾塔对叶碟喷施药剂1mL，每个浓度喷施3个叶碟，将受药叶碟放于恒温光照培养箱中培养24h，用体式显微镜观测害虫(螨)受药反应情况，记录死亡数，计算生物测定数据，获得敏感基线；步骤2：根据敏感基线，用80％的致死浓度(LC
80
)对害虫(螨)种群进行1代筛选，提取亲本和F1代害虫(螨)总RNA并进行转录组测序；依据敏感基线，用清水将待测杀虫(螨)剂制剂稀释至LC
80
浓度，将1000头害虫(螨)转移至新鲜叶碟中，每个叶碟100头，用potter喷雾塔对叶碟喷施药剂1mL，将受药叶碟放于恒温光照培养箱中培养24h，将存活的害虫(螨)挑入新鲜叶碟，待其产卵2d后移除，继续培养卵发育至成虫(螨)阶段，得到F1代；挑取亲本与F1代害虫(螨)约200头于1.5mL无酶离心管中，液氮速冻后，加入500μL Trizol，充分匀浆，向匀浆液中加入100μL氯仿，离心管放入高速冷冻离心机，12000rpm、4℃离心10min，将上清液小心转入新的无酶离心管中，加入异丙醇，将离心管放入高速冷冻离心机，12000rpm、4℃离心10min，弃去上清，沉淀用冰冷的75％乙醇洗一次；离心管放入冷冻离心机，8000rpm、4℃离心5min，弃上清，沉淀室温干燥3
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5min，待其即将变透明时加入30μL无酶水进行溶解，吸取所得RNA溶液5μL，其中2μL用于测浓度，3μL用于电泳检测其完整性，剩余25μL放入
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80℃冰箱备用；RNA样品首先采用epicentre Ribo
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Zero
TM
去除核糖体RNA(rRNA)，随后利用Fragmentation Buffer将RNA碎片化；以打碎的RNA片段为模板，用random hexamers引物合成cDNA第一链，最后通过PCR法富集纯化cDNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯楷阳，何林，刘家路，魏朋，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：