催化RebA生产RebM的重组糖基转移酶制造技术

本发明专利技术公开了催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶，编码所述重组糖基转移酶的重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体地涉及催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶、编码该酶的重组基因及表达催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的重组菌株及应用。

技术介绍

[0002]甜菊糖苷(Stevia)又称作甜菊糖(Stevia sugar)，是一种从植物甜菊叶片中提取获得的新型甜味剂。由于甜菊糖苷不产生热量，也不增加血糖水平，且甜度比蔗糖高出300倍，已作为非营养性甜味剂在某些国家被用于甜味食品几百年。莱鲍迪苷A(Rebaudioside A，Reb A)是其中主要的甜菊糖苷，为蔗糖甜度的300倍。然而，Reb A的苦涩味影响口感，研究发现莱鲍迪苷M(Rebaudioside M，Reb M)口感好苦涩味小，甜度可达蔗糖的400倍，被认为是新一代的甜菊源甜味剂。2014年，含有Reb M的甜菊源甜味剂获得了美国食品药品管理局(USFDA)的安全(Generally Recognized as Safe，GRAS)认证。
[0003]但Reb A含量为细胞干重的3.8％，Reb M含量为细胞干重的0.4％，仅微量存在于甜菊叶片中，传统的提取方法很难扩大生产规模。而随着编码合成甜菊糖苷Reb M的基因的鉴定，使酶法合成Reb M成为可能。有研究报道，天然甜菊叶中可通过尿苷二磷酸糖基转移酶(uridine diphosphate glycosyltransferase，UGTs)催化Reb A生成莱鲍迪苷D(Rebaudioside D，Reb D)，再将Reb D催化生成Reb M。
[0004]但是，Reb D水溶性(～0.04％)低于Reb A(～0.8％)，且价格与RebA相比更昂贵。因此，目前以Reb D为底物酶法生产Reb M的方式，存在底物Reb D水溶性低、价格昂贵等缺点。有研究使用两酶的混合物进行双酶体外级联催化，以Reb A为底物生产Reb M。但由于中间产物Reb D的水溶性较低限制了反应的正向进行，产物Reb M生成率仅为37.9％，限制了其工业应用。
[0005]因此，目前的生产Reb M的方法存在生产成本高，底物水溶性差，产率较低等问题。使用Reb A催化生产Reb M的方法可降低底物生产成本，但无法避免副产物的积累及较低的催化效率，需要采用有效措施减少副产物的积累并提高催化效率。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供一种编码上述重组糖基转移酶的重组基因。
[0008]本专利技术的第三个目的是提供一种表达催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的重组菌株。
[0009]本专利技术的第四个目的是提供上述重组菌株的诱导表达。
[0010]本专利技术的第五个目的是提供含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞催化Reb A生产Reb M的方法。
[0011]本专利技术的第六个目的是提供催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的酶液催化
Reb A生产Reb M的方法。
[0012]本专利技术的技术方案概述如下：
[0013]催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶。
[0014]编码上述重组糖基转移酶的重组基因，所述重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
[0015]表达催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的重组菌株，用下述方法构建：将上述重组基因构建至表达载体，获得重组载体；将所述重组载体转化宿主菌株中获得重组菌株。
[0016]表达载体优选为pPIC9K、pPIC9、pPinkα
‑
HC、pET
‑
28a、pMAL或pBAD30。
[0017]宿主菌株优选为大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母菌。
[0018]上述重组菌株的诱导表达，包括如下步骤：将上述重组菌株进行培养并加入诱导剂，在15
–
37℃，诱导表达6
–
27h，获得含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞；将所述菌体细胞破胞，得到催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的酶液。
[0019]含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞催化Reb A生产Reb M的方法，包括如下步骤：
[0020]取终OD
600
为25
–
250权利要求6所述的含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞或经过通透性处理的含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞，加入终浓度为1
–
10g/L Reb A、终浓度为4
–
10mM尿苷二磷酸葡萄糖和终浓度为0.4
–
1mM的Mn
2+
，加入终浓度为50mM的pH为7.2
–
8.0的PBS，在26℃
–
42℃、转速为50
–
250rpm、反应10
–
24h，催化生成Reb M；
[0021]所述经过通透性处理的含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞用下述方式制备：
[0022]方式一：将含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞在
‑
20
°
～
‑
80℃冷冻0.5
–
24h；
[0023]方式二：将含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞用终浓度为0.15
–
0.45g/L的细胞通透剂重悬，在20
–
30℃静置5min
–
1h；所述细胞通透剂为十六烷基三甲基溴化铵、曲拉通X
‑
100、聚山梨酯
‑
80或十二烷基硫酸钠。
[0024]催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的酶液催化Reb A生产Reb M的方法，包括如下步骤：
[0025]取终浓度为1
–
5g/L上述的催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的酶液，加入终浓度为1
–
10g/LReb A，终浓度为1
–
8mM尿苷二磷酸葡萄糖和终浓度为0.1
–
6mM金属离子，加入终浓度为50mM的pH为5.5
–
10.5的缓冲液，在26℃
–
42℃反应12
–
96h，催化生成Reb M；
[0026]所述金属离子为Mg
2+
、Mn
2+
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶。2.编码权利要求1所述重组糖基转移酶的重组基因，其特征在于，所述重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.8所示。3.一种表达催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的重组菌株，其特征是用下述方法构建：将权利要求2所述重组基因构建至表达载体，获得重组载体；将所述重组载体转化宿主菌株中获得重组菌株。4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于所述表达载体为pPIC9K、pPIC9、pPinkα
‑
HC、pET
‑
28a、pMAL或pBAD30。5.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于所述宿主菌株为大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母菌。6.权利要求3的重组菌株的诱导表达，其特征是包括如下步骤：将权利要求3所述重组菌株进行培养并加入诱导剂，在15
–
37℃，诱导表达6
–
27h，获得含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞；将所述菌体细胞破胞，得到催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的酶液。7.含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞催化Reb A生产Reb M的方法，其特征是包括如下步骤：取终OD
600
为25
–
250权利要求6所述的含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞或经过通透性处理的含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞，加入终浓度为1
–
10g/L Reb A、终浓度为4
–
10mM尿苷二磷酸葡萄糖和终浓度为0.4
–
1mM的Mn
2+
，加入终浓度为50mM的pH为7.2
–
8.0的PBS，在2...

【专利技术属性】
技术研发人员：马媛媛，王保淇，汪振洋，魏晓珍，宋浩，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：