利用人工内共生化技术选育羊肚菌优质品种的方法技术

本发明专利技术公开了一种选育羊肚菌优质品种的人工内共生化育种技术，该技术的实质在于将对羊肚菌人工栽培有益的酵母菌或细菌，例如限制马拉色菌、香气红冬孢锁掷孢酵母、土地杆菌、短波单胞菌、嗜甲基菌、鞘氨醇杆菌和黄杆菌等导入羊肚菌菌丝细胞内部，使双方建立内共生关系，然后从中筛选具有生长旺、产量高、抗逆性强等理想培养和生产性状的优质羊肚菌栽培品种。该技术操作包括羊肚菌原始菌株活化培养、将有益酵母菌或细菌导入到羊肚菌菌丝细胞内部及其鉴定、内共生化羊肚菌菌株培养性状和生产性状测定和逐级扩大人工栽培等工艺工程。本发明专利技术技术为羊肚菌育种开辟了一条新的有效途径，利于羊肚菌产业持续稳定发展。于羊肚菌产业持续稳定发展。于羊肚菌产业持续稳定发展。

【技术实现步骤摘要】
利用人工内共生化技术选育羊肚菌优质品种的方法


[0001]本专利技术属于生物育种的
，具体涉及到一种利用人工内共生化技术选育羊肚菌优质品种的方法。

技术介绍

[0002]羊肚菌(Morchella spp.)属于子囊菌门（Ascomycota），盘菌纲（Pezizomycetes），盘菌目（Pezizales），羊肚菌科（Morchellaceae），是国际上公认的珍贵食药兼用真菌。羊肚菌质地柔嫩，风味独特，并具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫调节和抗肿瘤等多种生理活性。目前我国规模化推广的羊肚菌室外“土壤栽培模式”于2012年首先在我国川渝地区成功应用，并很快推广到全国各地。据不完全统计，2021年我国羊肚菌栽培面积为25万亩（1亩为666.7 m2）左右，遍布全国除海南省以外的其他各省市区。
[0003]目前的羊肚菌育种主要依靠常规的自然选育，即从野生或栽培的子囊果出发，通过组织分离、多孢分离或单孢分离获得大量菌丝体分离物，再从中筛选理想的生产菌株。然而，随着羊肚菌人工栽培规模和面积的不断扩大，再加上羊肚菌本身容易老化和退化，自然羊肚菌种植资源日益枯竭等原因，使得优质栽培菌株（品种）的选育速度远远跟不上羊肚菌人工栽培发展的步伐，这也是影响羊肚菌栽培的稳定性，造成菇农损失的重要原因之一。因此，寻求高效育种新技术，促进羊肚菌良种选育，对稳定羊肚菌生产和获取人工栽培理想的经济效益具有显著的现实意义。
[0004]羊肚菌为土生菌，而土壤是微生物的大本营。羊肚菌在生长发育过程中，与土壤中的很多其他微生物发生着非常复杂的生态互作，包括拮抗、竞争和共生等，其中最重要的为共生关系。按照目前人们普遍接受的广义共生概念，共生不仅仅是一对一的互利共生关系，其实是包含互利共生、偏利共生和拮抗/寄生在内的共生连续体。在微生物之间的共生互作中，研究最为深入的是细菌
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真菌互作，即定殖于真菌菌丝细胞质或孢子细胞质内的内生细菌与真菌通过对抗、合作、协同、共栖及共生等类型的互作对彼此的生物学产生重要影响。
[0005]近年来，采取组学技术等先进技术手段，表征了羊肚菌生长发育过程中相关微生物群落变化规律，发现了一些可能对羊肚菌生长发育具有促进作用的细菌。例如，Zhang et al. (2019)采用复制子测序技术研究了人工栽培六妹羊肚菌等不同发育阶段的土壤细菌群落多样性，发现在原基分化阶段具有出乎预期高比例的假单胞菌(25.30%)，暗示假单胞菌可能影响羊肚菌生长（Zhang F, Long L, Hu Z, Yu X, et al. Analyses of artificial morel soil bacterial community structure and mineral element contents in ascocarp and the cultivated soil. Canadian Journal of Microbiology, 2019, 65: 738
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749）。L
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et al. (2021) 采用复制子测序检测了尖顶羊肚菌（M. conica）发育子实体的细菌群落动态变化，转录组共表达分析发现细菌群落在调节羊肚菌基因表达中可能发挥重要作用；该研究发现，黄杆菌（Flavobacterium）、假单胞菌（Pseudomonas）和土地杆菌（Pedobacter）在尖顶羊肚菌子实体的全部发育阶段占优势，暗示其在羊肚菌发育中发挥功能；该研究发现几种内生细菌群落，包括草螺菌、土地杆菌、
Arsenicitalea和杜擀氏菌（Duganella）与“细胞壁”和“蛋白酶调节亚基”富集的模块高度相关联，表明细菌群落可能通过调节与细胞壁合成和蛋白酶体相关途径特定酶的表达而促进子实体发育（L
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BB, Wu GG, Sun Y, Zhang LS, et al. Comparative transcriptome and endophytic bacterial community analysis of Morchella conica SH. Frontiers in Microbiology, 2021, 12: 682356）。
[0006]我们也采取宏基因组学技术（复制子测序等）进行了土壤微生物群落对羊肚菌生长发育影响的相关研究。我们的研究发现，与羊肚菌发育相关的细菌菌群有副土地杆菌（Parapedobacter）、类芽孢杆菌（Paenibacillus）、厌氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）等，这些细菌在播种前少量存在，菌丝体阶段大量富集，原基期和收获期种群数量减少，这些细菌可能是由羊肚菌菌丝养殖后期被羊肚菌降解作为营养消耗掉了。短波单胞菌属（Brevundimonas）、土地杆菌属（Pedobacter）、嗜甲基菌属（Methylobacillus）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、黄杆菌（Flavobacterium）、假单胞菌（Pseudomonas）、马赛菌（Massilia）和草螺菌（Herbaspirillum）、杜擀氏菌（Duganella）、氢噬菌属（Hydrogenophaga）等在原基期大量富集，表明它们可能与促进羊肚菌的原基和子实体发育有关。
[0007]在国外，人工内共生化（artificial endosymbiosis）为合成生物学的范畴，是指涉及建立自然界不存在的理想宿主内共生体关系的试验生物学或合成生物学过程。人工内共生化的终极目标是构建新型生物合成途径，可用于生物燃料生产、食品和农业、发酵工业、生物修复等行业；在新型代谢产物、生物肥料、化学品、酶和其他生物活性分子生产中也具有潜在应用价值；此外，还可用于建立在外空间和其他星球可以存活，或者可以适应地球巨大气候变化条件的新型生命形式（Puri KM, Butardo Jr V, Sumer H. Evaluation of natural endosymbiosis for progress towards artificial endosymbiosis. Symbiosis, 2021, 84: 1
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17）。然而，国内外均没有利用人工内共生化技术进行羊肚菌育种的研究和应用报道。
[0008]本专利技术将这些微生物（对羊肚菌人工栽培有益酵母菌和细菌）导入羊肚菌栽培菌株菌丝细胞内部，使双方建立了稳定的内共生关系，研究了外源有益微生物导入对羊肚菌生长发育的影响，建立了人工内共生化技术，发现该技术在选育羊肚菌产量高、抗性强等优质菌株方面具有较大的推广应用潜力。

技术实现思路

[0009]本专利技术所要解决的技术问题是针对羊肚菌人工栽培优质菌株（品种）选育技术单一，良种选育的速度远远跟不上羊肚菌人工栽培发展的步伐，影响了羊肚菌栽培的稳定性，造成菇农生产损失的问题，提供一种全新的人工内共生化育种方法，即将对羊肚菌生长本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用人工内共生化技术选育羊肚菌优质品种的方法，其特征在于：将对羊肚菌人工栽培有益的酵母菌或细菌导入羊肚菌菌丝细胞内部，多次纯化后，检测确认二者建立内共生关系，然后从中筛选具有理想培养和生产性状的优质羊肚菌栽培品种。2.根据权利要求1所述的利用人工内共生化技术选育羊肚菌优质品种的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）羊肚菌原始菌株活化培养；（2）将有益酵母菌或细菌导入到羊肚菌菌丝细胞内部；（3）内共生羊肚菌菌株的纯化；（4）外源细菌或酵母菌导入羊肚菌菌丝细胞内部鉴定；（5）内共生化羊肚菌菌株培养性状测定；（6）内共生化羊肚菌菌株生产性状测定。3.根据权利要求2所述的利用人工内共生化技术选育羊肚菌优质品种的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的羊肚菌原始菌株包括可进行人工栽培的梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、九妹羊肚菌、Mel
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13、Mel
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21；步骤（1）羊肚菌原始菌株活化培养是指将低温保藏的菌种接种到营养培养基平板上，在18
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25℃下避光培养至羊肚菌菌丝体蔓延至整个平板。4.根据权利要求1或2所述的利用人工内共生化技术选育羊肚菌优质品种的方法，其特征在于：对羊肚菌人工栽培有益酵母菌和细菌与羊肚菌在营养培养基平板上对峙培养，在双方菌落接触区不产生明显的种间竞争特征，双方在液体培养基共培养，酵母菌或细菌的生物量具有先增后减的特征。5.根据权利要求1或2所述的利用人工内共生化技术选育羊肚菌优质品种的方法，其特征在于：对羊肚菌人工栽培有益的酵母菌包括限制马拉色菌和香气红冬孢锁掷孢酵母，对羊肚菌人工栽培有益的细菌包括土地杆菌、短波单胞菌、嗜甲基菌、鞘氨醇杆菌和黄杆菌。6.根据权利要求2所述的利用人工内共生化技术选育羊肚菌优质品种的方法，其特征在于：步骤（2）将有益酵母...

【专利技术属性】
技术研发人员：何培新，刘伟，王文升，蔡英丽，曹满堂，陈卓，孙文化，
申请(专利权)人：河南君升农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：