斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法和应用，包括：确定hoxb1a基因的敲除靶点位于hoxb1a基因的第1个外显子上设计gRNA序列，以gRNA骨架质粒为模板进行PCR扩增，纯化，体外转录获得gRNA，将hoxb1a的gRNA与Cas9蛋白混合共同导入斑马鱼的单细胞期胚胎中，培养获得稳定遗传的hoxb1a基因缺失突变体。本发明专利技术首次利用CRISPR技术在斑马鱼基因组上进行hoxb1a基因敲除，实现斑马鱼中hoxb1a基因的特异敲除，可作为动物模型用于研究hoxb1a基因的生物学功能和与hoxb1a基因缺失相关的疾病。疾病。疾病。

【技术实现步骤摘要】
斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]近年来，CRISPR/Cas9系统编辑基因组的能力已经在很大程度上革新了基因组工程领域，这套系统最先发现于细菌的获得性免疫系统，噬菌体或质粒等外源DNA识别后被整合到CRISPR基因座上与重复序列一起串联形成短的间隔序列，接着这个CRISPR基因座被转录成成熟的小RNA叫做crRNA，每一个crRNA都包含着重复序列和一个单独的间隔序列。这些crRNA与对应的间隔序列正好反向互补，可以帮助识别间隔序列，此时crRNA若与Cas蛋白结合形成核糖核蛋白复合物，那么靶点处将会被Cas蛋白切割。而目前应用最广泛的CRISPR/Cas9系统属于CRISPR/Cas系统中的Type II，自2012年Doudna与Charpentier两个团队将crRNA和tracRNA改进成为一条gRNA，与Cas9成功实现在生物体内的基因编辑。但是在生物体中，一旦Cas9和sgRNA发挥作用后，会本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法，其特征在于，通过CRISPR/Cas9技术制备斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体，包括如下步骤：S1、确定hoxb1a基因敲除的靶点在斑马鱼hoxb1a基因第1个外显子上设计gRNA序列，其序列如SEQ ID NO:1所示；S2、设计合成hoxb1a gRNA所需的上游引物T7
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hoxb1a
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sfd和下游gRNA反向引物，序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；S3、以gRNA骨架质粒为模板，用上游引物T7
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hoxb1a
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sfd和下游gRNA反向引物进行PCR扩增；S4、对步骤S3的PCR产物进行体外转录获得gRNA，其序列如SEQ ID NO:6所示；S5、将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼中；S6、培养获得稳定遗传的斑马鱼hoxb1a基因突变体。2.根据权利要求1所述的斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法，其特征在于，步骤S5中，将gRNA与Cas9蛋白混合，显微注射到斑马鱼一细胞期胚胎中，其中gRNA终浓度为100ng/μL，Cas9蛋白终浓度为800ng/μL，每枚受精卵注射1nL。3.根据权利要求1所述的斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法，其特征在于，步骤S6具体包括如下步骤：A1、分别取导入gRNA与Cas9蛋白的斑马鱼以及野生型未注射的斑马鱼胚胎进行hoxb1a基因敲除检测，确定hoxb1a基因敲除阳性F0养至成鱼；A2、将hoxb1a基因敲除阳性F0成鱼与野生型斑马鱼外交进行可遗传性及有效突变检测，筛选可遗传的有效突变F1进行喂养至成鱼；经基因型鉴定获得hoxb1a F1突变体斑马鱼；A3、将相同突变的hoxb1a F1突变体斑马鱼内交，获得hoxb1a F2突变体斑马鱼；A4、鉴定为F2代中hoxb1a基因敲除的纯合子即为稳定遗传的斑马鱼hoxb1a基因突变体。4.根据权利要求3所述的斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法，其特征在于，步骤A1中，hoxb1a基因敲除...

【专利技术属性】
技术研发人员：祖尧，胡沛男，何宏阳，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：