一种血浆cfDNA含量及完整性的检测方法技术

本发明专利技术实施例公开了一种血浆cfDNA含量及完整性的检测方法。一种血浆cfDNA含量及完整性的检测方法，采用生物芯片分析系统对血浆cfDNA进行微流控电泳，根据峰面积得出cfDNA的浓度，并根据样品的峰图评估cfDNA的完整性。本发明专利技术通过生物芯片分析系统对cfDNA进行快速定量，使检测的灵敏性提高至皮克级，同时可以检测cfDNA的片段大小和分布范围，进而判断cfDNA的完整性，本发明专利技术检测方法具有操作简单、快捷、成本较低的优点。成本较低的优点。成本较低的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种血浆cfDNA含量及完整性的检测方法


[0001]本专利技术实施例涉及生物
，具体涉及一种血浆cfDNA含量及完整性的检测方法。

技术介绍

[0002]人血浆游离DNA(Cell
‑
free，cfDNA)存在于多种体液中，如血液、尿液、粪便、乳汁和腹水等，且通常肿瘤患者的cfDNA水平高于健康人，主要来源于肿瘤细胞的坏死、凋亡或者自发性释放，大部分以核小体的形式存在。研究发现肿瘤患者的cfDNA携带与肿瘤相关的遗传变异信息，具有较高的临床应用价值成为新的无创诊断的标记物，因此，对cfDNA的定量检测分析为癌症早期诊断、复发预警和疗效预测提供了一种有效的检测手段。目前的研究方法需要先从血浆中提取DNA，然后针对基因组中的某个基因的方法，如管家基因β
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actin，β
‑
globin等，或重复序列Line基因等，以cfDNA为模板，通过时实荧光定量PCR来计算cfDNA基因组拷贝数。
[0003]由于cfDNA在血浆含量和完整性随不同个体、不同病理状态变化而变化，且不同提取方法和试剂对cfDNA影响不同，部分cfDNA样本含量微弱，Qubit荧光计进行定量方法特异性差，不能够对cfDNA进行精确定量；时实光定量PCR的方法具有较好的特异性和灵敏性，但无法对cfDNA的完整性做出评估，该方法通常是针对基因组上的某一基因，当提取的cfDNA存在基因组污染时，PCR的方法不能真实的反应cfDNA的真实含量。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是建立一种血浆cfDNA含量及完整性的检测方法，该方法能够排除基因组污染对cfDNA定量的影响，同时对样品的污染程度进行评估。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：
[0006]一种血浆cfDNA含量及完整性的检测方法，采用生物芯片分析系统对血浆cfDNA进行微流控电泳，根据峰面积得出cfDNA的浓度，并根据样品的峰图评估cfDNA的完整性。
[0007]进一步地，所述血浆cfDNA的提取方法包括：
[0008]外周血经EDTA
‑
K2抗凝后，进行第一离心，得第一上层血浆；
[0009]对所述第一上层血浆进行第二离心，得第二上层血浆；
[0010]对所述第二上层血浆进行游离DNA提取，得所述血浆cfDNA。
[0011]进一步地，所述第一离心在1200g
‑
2000g下离心5
‑
20分钟。
[0012]进一步地，所述第二离心在12000g
‑
20000g下离心5
‑
20分钟。
[0013]进一步地，用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取试剂盒对所述第二上层血浆进行游离DNA提取。
[0014]进一步地，所述生物芯片分析系统为Agilent 2100生物芯片分析系统。
[0015]进一步地，若峰图显示集中的片段＜170bp，说明血浆cfDNA样品降解严重；若峰图显示集中的片段高于800
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1000bp，说明血浆cfDNA样品中存在基因组DNA的污染。
[0016]2100生物分析仪可以直接提供被检测样本的浓度值，其原理是仪器通过拟合峰图的面积来计算DNA浓度值。
[0017]cfDNA由于它的特性，是由缠绕在核小体上的DNA断裂后形成的游离DNA，而DNA缠绕在核小体的时候，缠绕一圈为170bp左右，因此cfDNA的特性就是170bp的整数倍，其中170bp占比最大，340bp占比次之，随后是510bp。2100生物分析仪可以评估微量样本的DNA片段大小，所以通过2100生物分析仪可以直观看到cfDNA的片段分布，看是否符合上述特性。如果集中的片段＜170bp左右，就说明cfDNA样品降解严重，如果集中的片段高于800
‑
1000bp，则说明cfDNA样品存在基因组DNA的污染。
[0018]本专利技术实施例具有如下优点：
[0019]本专利技术通过生物芯片分析系统对cfDNA进行快速定量，使检测的灵敏性提高至皮克级，同时可以检测cfDNA的片段大小和分布范围，进而判断cfDNA的完整性，本专利技术检测方法具有操作简单、快捷、成本较低的优点。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
[0021]图1为使用Agilent 2100生物芯片分析系统对样本DP13AN00200进行DNA片段的分析图；
[0022]图2为使用Agilent 2100生物芯片分析系统对样本EP158987进行DNA片段的分析图。
具体实施方式
[0023]以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0024]实施例1
[0025]本实施例提供一种血浆cfDNA含量及完整性的检测方法，包括如下步骤：
[0026](1)收集肿瘤患者的外周血10ml，置于EDTA
‑
K2抗凝管中，1600g离心10min，取上层血浆5ml，16000g离心10min后，取上层血浆用Qiagen公司QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit试剂盒进行提取，提取步骤具体操作如下：
[0027]1.1准备50mL离心管，加入500μL QIAGEN Proteinase K至离心管底；
[0028]1.2加入5mL血浆(不足5mL的用水补足)至上述50mL离心管中；
[0029]混合Buffer ACL和Carrier RNA溶液，轻轻颠倒10次混匀(避免气泡产生，不能vortex)，此步结束后应立即进行下一步；
[0030]1.3加入4.0mL Buffer ACL(含有1μg Carrier RNA)，pulse
‑
vortexing混匀30s；
[0031]1.4 60℃孵育30min(注意：孵育之前将50mL离心管盖稍稍拧松，避免加热时管盖
太紧里面气压太大将管崩裂)；注：此步可以使用水浴；
[0032]1.5将管子从60℃取下，置于实验台上，旋开管盖；
[0033]1.6加入9.0mL Buffer ACB(检查是否加入200ml异丙醇)，pulse
‑
vortexing混匀15s...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血浆cfDNA含量及完整性的检测方法，其特征在于，采用生物芯片分析系统对血浆cfDNA进行微流控电泳，根据峰面积得出cfDNA的浓度，并根据样品的峰图评估cfDNA的完整性。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述血浆cfDNA的提取方法包括：外周血经EDTA
‑
K2抗凝后，进行第一离心，得第一上层血浆；对所述第一上层血浆进行第二离心，得第二上层血浆；对所述第二上层血浆进行游离DNA提取，得所述血浆cfDNA。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述第一离心在1200g
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2000g下离心5
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20分钟。4.根据权利要求2所述的检测方...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈威，马明飞，张振宇，
申请(专利权)人：北京芯高地生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：