一种利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌Alternaria alternata的方法，包括如下步骤：借助PCR技术对杭白菊黑斑病菌Alt特异性基因片段进行扩增；在crRNA的介导下，Cas12a可特异性识别扩增产物，并激活核酸酶活性，从而切割两端修饰有FAM和BHQ1的任意碱基序列ssDNA(Reporter)，形成FAM

【技术实现步骤摘要】
一种利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌的方法


[0001]本专利技术属于生物与化学领域，涉及一种利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌Alternaria alternata(A.alternata，Alt)的方法。

技术介绍

[0002]规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR,Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)是许多细菌和古细菌中的一种应对入侵的免疫机制。CRISPR及CRISPR相关蛋白(CRISPR associated proteins,Cas)被称为CRISPR/Cas系统。Cas12a为第2类V型Cas蛋白，它在未激活时无切割活性，当其与特定的crRNA结合后，Cas12a构象将发生改变，与crRNA结合形成Cas12a
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crRNA二元复合物。该复合物能特异性得识别靶标DNA，并激活其核酸内切酶活性。当Cas12a依次对DNA双链进行顺式切割后，该活性位点将持续暴露，展现出反式切割活性，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌Alternaria alternata的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤一：对杭白菊黑斑病菌A.alternata基因组中的特异性目的基因片段进行PCR扩增；PCR扩增所用引物序列包括：Alt
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PCR
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F，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；Alt
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PCR
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R，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；步骤二：将扩增的PCR产物加入含CRISPR/Cas体系的反应管中，孵育，所述的CRISPR/Cas体系包括针对目的基因的特异性crRNA、CRISPR/Cas12a蛋白和用于酶标仪荧光检测的reporter序列；crRNA的序列如SEQ ID No.3所示；在crRNA的介导下，CRISPR/Cas12a蛋白特异性识别特异性基因片段的扩增片段，并激活核酸酶活性，从而切割两端修饰有FAM和BHQ1的reporter序列，形成FAM
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ssDNA与BHQ1
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ssDNA；步骤三：FAM
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ssDNA与BHQ1
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ssDNA在蓝光投射仪下显现出荧光，实现对于杭白菊黑斑病菌Alternaria alternata的可视化检测。2.如权利要求1所述的利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌Alternaria alternata的方法，其特征在于：步骤一中，PCR程序为：95℃预变性3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，共循环30次；后72℃延伸10...

【专利技术属性】
技术研发人员：申屠旭萍，宋阳，刘妍，俞晓平，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：