一种BacillomycinD高活性菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于分子生物学和微生物发酵领域，提供一种Bacillomycin D高活性菌株及其构建方法和应用。该菌株构建方法包括如下步骤：同源臂的扩增、目的基因的扩增、融合片段扩增、线性载体扩增、重组整合质粒获得、转化子获得及检测。本发明专利技术利用温敏型质粒pKS2介导的同源重组双交换的方法，将Iturin A合成酶操纵子中的硫酯酶结构域IA

【技术实现步骤摘要】
一种Bacillomycin D高活性菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学和微生物发酵领域，具体涉及一种Bacillomycin D高活性菌株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]Bacillomycin D是由解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)等芽孢杆菌属微生物合成的一类次级代谢产物，是抗菌脂肽Iturins家族的重要成员。Bacillomycin D属于非核糖体肽，其合成途径为聚酮体合成酶系和非核糖体肽合成酶系杂合途径，其合成酶操纵子由4个ORFs构成，分别为bamD、bamA、bamB和bamC，编码BamD、BamA、BamB和BamC亚基。BamC亚基C末端含有一个硫酯酶结构域(Thioesterase，TE)，属于
ɑ
/β水解酶家族，能断裂肽基载体蛋白(PCP)和酰基分子之间的共价硫脂键，负责环脂肽中间体的环化和水解。此外TE结构域还具有寡聚化、差向异构化等其他功能。近年来，硫酯酶结构域的区域特异性、化学特异性和立体特异性被广泛研究，研究者已经阐明了多种硫酯酶的蛋白晶体结构与作用机理，有望可通过酶催化结合化学合成获得特定的产物。
[0003]Bacillomycin D由亲油的β
‑
氨基脂肪酸链(C
14
‑
C17
)和亲水的肽链(Asn
‑
Tyr
‑
Asn
‑
Pro
‑
Glu
‑r/>Ser
‑
Thr)构成，两部分通过苏氨酰
‑
β
‑
氨基键连接成环。Bacillomycin D具有两亲性，能有效抑制黄曲霉菌、赭曲霉菌等病原真菌，破坏其脂质双分子层，导致细胞膜的通透性、流动性和完整性发生变化，从而使细胞质成分外泄，最终导致细胞死亡。因此未来有潜力将Bacillomycin D开发成高效的食品防腐剂，应用于食品和粮食安全，然而野生菌株合成Bacillomycin D的能力有限，产量难以达到工业化要求。
[0004]因此需要寻找更加有效的提高Bacillomycin D产量的菌株。

技术实现思路

[0005]为了克服野生菌株成Bacillomycin D的能力有限的问题，本专利技术提供一种Bacillomycin D高活性菌株及其构建方法和应用。本专利技术获得的产Bacillomycin D的高活性菌株，产量为野生菌株的1.31倍。
[0006]本专利技术目的通过如下手段获得：
[0007]第一方面，本专利技术保护一种重组质粒pKS2
‑
IA
‑
TE，包含解淀粉芽孢杆中IturinA合成酶操纵子硫酯酶(TE)基因。
[0008]优选的，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LZ
‑
5。
[0009]其中，所述重组质粒pKS2
‑
IA
‑
TE的构建方法如下：
[0010](1)设计引物对IA
‑
U
‑
F和IA
‑
U
‑
R、IA
‑
D
‑
F和IA
‑
D
‑
R、IA
‑
TE
‑
F和IA
‑
TE
‑
R；以解淀粉芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板，PCR扩增上游同源臂IA
‑
U、下游同源臂IA
‑
D；以解淀粉芽孢杆菌LZ
‑
5基因组DNA为模板，PCR扩增Iturin A合成酶操纵子中的硫酯酶结构域IA
‑
TE；
[0011](2)以IA
‑
U
‑
F和IA
‑
TE
‑
R为引物，上述(1)中获得的IA
‑
U和IA
‑
TE为模板，通过重叠
延伸PCR获得融合片段IA
‑
U
‑
TE；
[0012](3)以IA
‑
U
‑
F和IA
‑
D
‑
R为引物，上述(1)中获得的IA
‑
D和(2)中获得的IA
‑
U
‑
TE为模板，再次重叠延伸PCR获得融合片段IA
‑
U
‑
TE
‑
D；
[0013](4)设计引物对Linear
‑
pKS2
‑
F和Linear
‑
pKS2
‑
R，以消除BamHI限制性酶切位点的温敏型质粒pKS2
‑
ΔBamHI为模板，PCR扩增获得线性载体Linear
‑
pKS2；
[0014](5)用ClonExpress II One Step Cloning Kit中的重组酶将融合片段IA
‑
U
‑
TE
‑
D和线性载体Linear
‑
pKS2连接成重组整合质粒pKS2
‑
IA
‑
TE。
[0015]优选的，步骤(1)所述的引物对序列如下：
[0016]IA
‑
U
‑
F：TATAGGGCGAATTGGGTACCGACGAGGGCAGAAGCAACAT；
[0017]IA
‑
U
‑
R：TCGAAAACGGCCGCTTGAATGGCGCGTGCCATTGT；
[0018]IA
‑
D
‑
F：ACGGATTGAAGAACGGCATCATCACGGACT；
[0019]IA
‑
D
‑
R：GCTTATCGATACCGTCGACCTGCCGGATCAAAAAGCCA；
[0020]IA
‑
TE
‑
F：ATTCAAGCGGCCGTTTTCGAA；
[0021]IA
‑
TE
‑
R：GATGCCGTTCTTCAATCCGTTTAATAATAGATCGAAT。
[0022]优选的，步骤(4)所述的引物对序列如下：
[0023]Linear
‑
pKS2
‑
F：GGTCGACGGTATCGATAAGCTT；
[0024]Linear
‑
pKS2
‑
R：GGTACCCAATTCGCCCTATAGTG。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒pKS2
‑
IA
‑
TE，其特征在于，包含解淀粉芽孢杆中IturinA合成酶操纵子硫酯酶(TE)基因；优选的，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LZ
‑
5。2.权利要求1所述的重组质粒pKS2
‑
IA
‑
TE的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)设计引物对IA
‑
U
‑
F和IA
‑
U
‑
R、IA
‑
D
‑
F和IA
‑
D
‑
R、IA
‑
TE
‑
F和IA
‑
TE
‑
R；以解淀粉芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板，PCR扩增上游同源臂IA
‑
U、下游同源臂IA
‑
D；以解淀粉芽孢杆菌LZ
‑
5基因组DNA为模板，PCR扩增Iturin A合成酶操纵子中的硫酯酶结构域IA
‑
TE；(2)以IA
‑
U
‑
F和IA
‑
TE
‑
R为引物，上述(1)中获得的IA
‑
U和IA
‑
TE为模板，通过重叠延伸PCR获得融合片段IA
‑
U
‑
TE；(3)以IA
‑
U
‑
F和IA
‑
D
‑
R为引物，上述(1)中获得的IA
‑
D和(2)中获得的IA
‑
U
‑
TE为模板，再次重叠延伸PCR获得融合片段IA
‑
U
‑
TE
‑
D；(4)设计引物对Linear
‑
pKS2
‑
F和Linear
‑
pKS2
‑
R，以消除BamHΙ限制性酶切位点的温敏型质粒pKS2
‑
ΔBamHΙ为模板，PCR扩增获得线性载体Linear
‑
pKS2；(5)用ClonExpress II One Step Cloning Kit中的重组酶将融合片段IA
‑
U
‑
TE
‑
D和线性载体Linear
‑
pKS2连接成重组整合质粒pKS2
‑
IA
‑
TE。3.重组菌，其特征在于，为提高解淀粉芽孢杆菌的抗菌脂肽Bacillomycin D产量得到的重组菌，所述重组菌包含解淀粉芽孢杆中IturinA合成酶操纵子硫酯酶(TE)基因；优选的，出发菌株为解淀粉芽孢杆菌fmbJ，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ，由南京农业大学酶工程实验室自主筛选所得，菌种保藏号为CGMCC No.0943。4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，提高抗菌脂肽Bacillomycin D产量的方法如下：将Bacillomycin D合成酶操纵子中的硫酯酶结构域替换成Iturin A合成酶操纵子中的硫酯酶结构域；优选的，所述替换通过同源重组实现。5.权利要求3
‑
4任一所述的重组菌的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)设计引物对IA
‑
U
‑
F和IA
‑
U
‑
R、IA
‑
D
‑
F和IA
‑
D
‑
R、IA
‑
TE
‑
F和IA
‑
TE
‑
R；以解淀粉芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板，PCR扩增上游同源臂IA
‑
U、下游同源臂IA
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：别小妹，张平，陆兆新，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：