复合菌及其在降解长链烷烃中的应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，尤其涉及复合菌及其在降解长链烷烃中的应用。本发明专利技术提供了工程解脂耶氏酵母和球拟假丝酵母的复合菌，较单一菌株而言，该复合菌能协同作用，烷烃降解率更高。工程解脂酵母单菌培养时的烷烃降解率为75.12％；球拟假丝酵母单独降解烷烃的降解率为51.48％且生长状态差；复合菌中单菌生长状态得到改善、烷烃降解效率提高，降解率为81.57％；复合菌进行优化，降解效率进一步提高，降解率为85.49％；同时复合菌中解脂酵母烷烃降解相关基因转录通过动态调整来降低彼此代谢负担，从而协同提高烷烃降解效率。从而协同提高烷烃降解效率。

【技术实现步骤摘要】
复合菌及其在降解长链烷烃中的应用


[0001]本专利技术涉及微生物
，尤其涉及复合菌及其在降解长链烷烃中的应用。

技术介绍

[0002]研究表明，目前发现的石油烃降解微生物有200多种，包括细菌、真菌、酵母、放线菌、霉菌和藻类，目前研究较多的是细菌和真菌。石油烃生物降解具有安全可靠、成本低、处理效果好、无二次污染等特点。目前生物降解大多采用强化土著降解菌株或投加高效降解菌株或菌群来实现。例如，两株促生长的细菌通过促进真菌菌丝的生长，从而提高了该三菌体系对多环芳烃的降解；四株菌的复配体系在降解萘和蒽的同时，还能生产表面活性剂；由分离出的6株石油烃降解菌组成的混合菌群对C8
‑
C35的降解率显著高于单个降解菌的降解率；利用8株霉菌、3株酵母菌和4株细菌分别采取细菌混合培养、真菌混合培养、细菌和真菌混合培养等不同的组合方式进行石油烃降解实验；也有利用解脂酵母工程菌株与铜绿假单胞菌进行复配，其石油烃降解效率可达到91.63％，但其高石油烃降解效率主要取决于铜绿假单胞菌，复配菌株协作效果不明显。
[0003]同时由于大多微生物体内酶多为水溶性，因此很难直接将菌株或复配菌群直接作用于石油污染物，需要促溶剂增加进微生物与污染物的接触。表面活性剂能够增溶，且适用性广。有研究表明表面活性剂可提高石油烃降解微生物降解效率。但具有能够生产表面活性剂，且有较高石油烃降解效率和广谱石油烃降解的微生物还很少，实际可用到生物修复中的高效菌株则更少。如何筛选并复配得到降解效率高，性能广谱的菌株仍有待解决。而且，现有的石油烃降解土著或复配菌群，存在菌株间分工不明确、代谢不平衡、竞争与协作共存和相互作用关系错综复杂等问题。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供复合菌及其在降解长链烷烃中的应用。
[0005]本专利技术提供了一种复合菌，包括解脂耶氏酵母和球拟假丝酵母。
[0006]在本专利技术中，所述球拟假丝酵母为产槐糖脂的球拟假丝酵母。所述在一些具体实施例中，本专利技术所述的球拟假丝酵母为Candida bombicola ATCC22214菌株。
[0007]解脂耶氏酵母可利用槐糖脂提高其烷烃降解效率，本专利技术将这两种菌复配形成的复合菌能够协作共存、互利互惠。在一些具体的实施例中，工程解脂酵母单菌培养时的烷烃降解率为75.12％；进一步的，菌种复配后的降解率为降解率为81.57％；更进一步的复合菌经优化的降解率可达85.49％。其中，所述的球拟假丝酵母自身代谢产生的槐糖脂可作为表面活性剂，在烷烃降解过程中可充当促溶剂，增加微生物与石油烃的接触，从而提高烷烃降解效率。
[0008]在一些具体实施例中，本专利技术所述的复配菌与单菌转录水平进行比较，复配菌内源与烷烃降解相关的基因在第三天均有大幅度上调。具体的，内源烷烃降解基因为Alk1、
Alk2、Alk5和ABC1，Alk1、Alk2、Alk5为烷烃羟化酶编码基因，ABC1为烷烃转运酶编码基因，他们均在烷烃降解过程中其至关重要的作用。进一步的，外源LadA转录水平也有提高。
[0009]在本专利技术中，所述解脂耶氏酵母是以解脂耶氏酵母ATCC 201249为底盘的基因工程菌。进一步的，在一些具体实施例中，所述解脂耶氏酵母表达LadA、AlmA2、ABC1基因中至少一种。本专利技术中，LadA、AlkM为烷烃羟化酶基因，是经过解脂耶氏酵母密码子优化的，其编码的烷烃羟化酶的酶活力及表达量的提高可以促进菌株降解烷烃。ABC1基因编码产物为烷烃转运蛋白，负责物质的跨膜转运，菌株过表达ABC1，可提高其烷烃降解效率。
[0010]本专利技术所述的复合菌中的解脂耶氏酵母，基因型包括如下所述的任意一种：
[0011]ATCC 201249Δku80::PFBAin
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LadA
‑
octt,hisG；
[0012]ATCC 201249Δku80::PFBAin
‑
AlmA2
‑
octt,hisG；
[0013]ATCC 201249harboring PINA1269
‑
ABC1；
[0014]ATCC 201249Δku80::PFBAin
‑
LadA
‑
octt,hisG harboring PINA1269
‑
ABC1。
[0015]在本专利技术中，所述的解脂耶氏酵母和球拟假丝酵母比为(1～4)：(1～4)。
[0016]进一步的，本专利技术所述的比(1～4)：(1～4)为此区间中任意数值组成的比值，本专利技术对此不做限定。
[0017]更进一步的，本专利技术所述的比是以接种密度进行配比。
[0018]在一些具体实施例中，本专利技术所述的比是通过固定解脂酵母的初始OD
600
为0.1，调整球拟假丝酵母的添加量来达到固定配比，具体的，解脂耶氏酵母和球拟假丝酵母比为：1：1、1：2、1：4、2：1或4：1。更进一步的，解脂酵母与球拟假丝酵母的接种比例为2：1时，复合菌正十六烷降解效率最高，为84.04％。
[0019]本专利技术提供了降解石油烃的产品，原料包括本专利技术所述的复合菌。
[0020]进一步的，本专利技术所述的产品的制剂类型可以为菌粉、颗粒或菌液，本专利技术对此不做限定，其都可以应用于石油烃的降解中。本专利技术所述的降解石油烃的产品的制备方法包括将解脂耶氏酵母和球拟假丝酵母进行混合。可以为，将解脂耶氏酵母和球拟假丝酵母混合后进行培养制得所述产品。还可以为将解脂耶氏酵母和球拟假丝酵母混合、培养后进行冻干。本专利技术所述的降解石油烃的产品中，还包括复苏培养基，所述复苏培养基中，碳源包括葡萄糖、蔗糖或TCA中间代谢产物。
[0021]本专利技术提供了所述的复合菌和/或产品在降解石油烃中的应用。进一步的，包括复合菌以冻干粉或菌液形式、产品以菌粉、颗粒或菌液的制剂形式用于石油烃降解，本专利技术对此不做限定。
[0022]本专利技术中，所述的石油烃包括：正烷烃、支链烷烃、环烷烃、芳烃等烃类物质和少量其他有机物。本专利技术以十六烷烃为受试对象，鉴定菌株对石油烃的降解效果。
[0023]本专利技术还提供了一种石油烃的降解方法，包括利用如本专利技术所述的复合菌，和/或本专利技术所述的降解石油烃的产品对石油烃进行降解。
[0024]具体的，本专利技术所述的降解方法包括将所述复合菌或所述降解石油烃的产品加入含有石油烃的待降解物中。
[0025]本专利技术所述的降解方法中，所述降解的基质包括葡萄糖、蔗糖或TCA中间代谢产物。其中，所述TCA中间代谢包括琥珀酸、柠檬酸或酮戊二酸。
[0026]在一些具体实施例中，所述降解的基质中含有葡萄糖。实验表明，本专利技术所述的降
解方法，添加外源葡萄糖烷烃降解效果最好。更进一步的，以葡萄糖添加量为20g/L的时其烷烃降解效率最好，烷烃降解效率高达85.49％。
[0027]在本专利技术中，所述降解的温度为25本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.复合菌，其特征在于，包括解脂耶氏酵母和球拟假丝酵母。2.根据权利要求2所述的复合菌，其特征在于，所述解脂耶氏酵母表达AlmA1、AlkM、ABC1基因中至少一种。3.根据权利要求1或2所述的复合菌，其特征在于，所述解脂耶氏酵母的底盘菌为ATCC 201249。4.根据权利要求1～3任一项所述的复合菌，其特征在于，所述解脂耶氏酵母的基因型为：ATCC 201249Δku80::PFBAin
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LadA
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octt,hisG；ATCC 201249Δku80::PFBAin
‑
AlmA2
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octt,hisG；ATCC 201249harboring PINA1269
‑
ABC1；ATCC 201249Δku80:...

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，王妍，丁明珠，王敏蓁，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：