一种高效合成羟基酪醇的地衣芽胞杆菌、构建方法及应用技术

本发明专利技术属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种高效合成羟基酪醇的地衣芽胞杆菌、构建方法及其应用。本发明专利技术首先在地衣芽胞杆菌DW2基础上进一步进行多种改造，获得重组地衣芽胞杆菌DH7；选择来源于大肠杆菌中的4

【技术实现步骤摘要】
一种高效合成羟基酪醇的地衣芽胞杆菌、构建方法及应用


[0001]本专利技术属于微生物基因工程
，具体涉及一种高效合成羟基酪醇的地衣芽胞杆菌、构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]羟基酪醇(Hydroxytyrosol，HT)又叫3,4
‑
二羟基苯乙醇，是一种生物活性多酚，是目前已知的最强的天然抗氧化剂之一。羟基酪醇可以清除自由基，减少低密度脂蛋白的氧化，刺激钙的沉积。它还具有抗癌、抗炎和抗微生物活性。因此，羟基酪醇可用于化妆品、食品、保健品和医疗行业。
[0003]目前，HT是通过植物提取或化学合成在工业上制造的。自然界中，HT以橄榄苦苷的形式存在于橄榄植物中，可以从新鲜橄榄叶和橄榄加工废水中提取羟基酪醇。尽管这些材料丰富且价格低廉，但也存在一些缺点，例如收率低、酸性水蒸汽强和方法的持续时间长。化学合成则利用HT的一些类似物，如3,4
‑
二羟基苯乙酸、3,4
‑
二羟基苯甲醛和酪醇等作为底物合成羟基酪醇，这些方法由于基材昂贵、条件恶劣、步骤复杂或产量低不适合大规模工业化生产。
[0004]随着代谢工程和合成生物学的进步，通过重建天然途径或在微生物中引入人工生物合成途径，已经实现了从简单碳源从头生产HT。目前大多数报道都是利用大肠杆菌经过微生物改造合成羟基酪醇，这为微生物发酵法生产羟基酪醇奠定了重要基础。但是利用简单碳源从头合成HT，合成途径较长，代谢负担重，也存在效率不高和底物转化率低的问题，需要进一步提高从头效率以实现经济生产HT。/>
技术实现思路

[0005]针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术的目的之一是提供一种高效合成羟基酪醇的地衣芽胞杆菌。开发一种重组地衣芽胞杆菌，在产酪醇的地衣芽胞杆菌中优化表达合成羟基酪醇的基因酮酸脱羧酶基因以及羟化酶基因，构建异源合成羟基酪醇的地衣芽胞杆菌菌株。
[0006]本专利技术的另一个目的在于提供上述重组地衣芽胞杆菌在生产羟基酪醇中的应用。
[0007]为了解决上述问题，本专利技术的技术方案如下：
[0008]一种高效合成羟基酪醇的地衣芽胞杆菌，包括如下步骤：
[0009]依次敲除地衣芽胞杆菌DW2中的丙酮酸激酶基因pyk、酪氨酸/苯丙氨酸转氨酶基因hisC和醛脱氢酶基因dhaS，醇脱氢酶基因adhA获得地衣芽胞杆菌DH4，将tyrA
fbr
基因整合至地衣芽胞杆菌DH4的ldh的位点，获得地衣芽胞杆菌DH5，将地衣芽胞杆菌DH5中的基因，aroK和aroA启动子均替换为PbacA，获得地衣芽胞杆菌DH7；
[0010]将大肠杆菌BL21(DE3)基因组中4
‑
羟基苯乙酸
‑3‑
羟化酶基因hpaBC与kivD
V461A
或kivD
V461I
进行共表达，然后转入DH7中，kivD
V461A
序列为SEQ ID NO.89所示，kivD
V461I
序列为SEQ ID NO.90所示。
[0011]其中hpaBC的启动子可以为：PbacA，P43或Pbay；
[0012]kivD
V461A
或kivD
V461I
的启动子可以为：PbacA，P43或Pbay。
[0013]本专利技术的保护范围还包括：上述的地衣芽胞杆菌用于合成羟基酪醇。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0015]1、本专利技术在地衣芽胞杆菌DH7中过表达KivD突变体(V461A和V461I)和HpaBC的目的基因。通过这些酶在重组地衣芽胞杆菌DH7中的有效表达，菌株可以利用葡萄糖为底物从头合成羟基酪醇，合成成本低廉，操作简单。
[0016]2、本专利技术利用强启动子P43、PbacA和Pbay高效驱动外源基因在重组地衣芽胞杆菌DH7中特异性表达，提高了重组表达载体的构建和转化效率，进而有效提高了地衣芽胞杆菌合成羟基酪醇的能力，提高了羟基酪醇的产量。
附图说明
[0017]图1为羟基酪醇的合成路线。
[0018]图2为DW2/pHY300和HT1羟基酪醇液相图。
具体实施方式
[0019]下面结合实施例对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术的保护范围不仅限于这些实施例。
[0020]实施例1：
[0021]基因工程菌株DH7的构建：
[0022](1)敲除pyk、hisC和dhaS：以地衣芽胞杆菌DW2的基因组为模板，利用引物pyk
‑
AF/AR和pyk
‑
BF/BR分别扩增丙酮酸激酶基因pyk片段的上下游同源臂，将上下游同源臂片段融合得到pyk敲除盒；利用引物(T2
‑
T5
‑
F/R)，以质粒T2(2)
‑
ori为模板扩增骨架；将pyk敲除盒插入质粒T2中，利用T2
‑
F/T2
‑
R进行菌落PCR，获得阳性转化子，经过DNA测序，成功构建pyk敲除质粒T2
‑△‑
pyk，导入地衣芽胞杆菌DW2中(或称为地衣芽孢杆菌DW2，CN112226437A)，通过同源重组获得pyk敲除菌株DH1；酪氨酸/苯丙氨酸转氨酶基因hisC和醛脱氢酶基因dhaS敲除载体构建方法同pyk，并通过迭代敲除获得pyk，hisC和dhaS基因同时敲除的菌株DH3；
[0023]其中，pyk敲除所需引物序列为：
[0024]pyk
‑
AF：ctgcagcccgggggatccgggatacagctacatccc
[0025]pyk
‑
AR：ttaaagtacgcttgcacgcggcccaattgtacaaact
[0026]pyk
‑
BF：agtttgtacaattgggccgcgtgcaagcgtactttaa
[0027]pyk
‑
BR：gatcttttctacgagctcgcggcagcctgctttttc
[0028]T2
‑
T5
‑
F：ggatcccccgggctgcaggaattc
[0029]T2
‑
T5
‑
R：gagctcgtagaaaagatcaaagga
[0030]T2
‑
F：atgtgataactcggcgta
[0031]T2
‑
R：gcaagcagcagattacgc
[0032]pyk
‑
YF:ttctcggattgatcatgg
[0033]pyk
‑
YR:aacggcttgacgactttc
[0034]敲除hisC的引物
[0035]hisC
‑
AF：ctgcagcccggggg本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成羟基酪醇的地衣芽胞杆菌的制备方法，包括下述步骤：依次敲除地衣芽胞杆菌DW2中的丙酮酸激酶基因pyk、酪氨酸/苯丙氨酸转氨酶基因hisC和醛脱氢酶基因dhaS，醇脱氢酶基因adhA获得地衣芽胞杆菌DH4，将tyrA
fbr
基因整合至地衣芽胞杆菌DH4的ldh的位点，获得地衣芽胞杆菌DH5，将地衣芽胞杆菌DH5中的基因，aroK和 aroA启动子均替换为PbacA，获得地衣芽胞杆菌DH7；将大肠杆菌BL21（DE3）基因组中4
‑
羟基苯乙酸
‑3‑
羟化酶基因hpa...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，周飞，占杨杨，许海霞，尹昊，蔡冬波，马昕，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：