一种人工虎骨多肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种人工虎骨多肽及其制备方法和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，制备过程如下：首先取1g人工虎骨粉于300mL超纯水，80℃水浴提取4小时，离心取上清即得人工虎骨多肽溶液，将上述溶液经过3KD超滤膜超滤，收集滤过液，

【技术实现步骤摘要】
一种人工虎骨多肽及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医疗技术，尤其涉及一种人工虎骨多肽及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]虎骨为虎的骨骼，出自《本草经集注》。虎骨，辛，甘，咸，温，古文中记载虎骨擅长祛邪气，定惊痫，强筋骨等作用，适用于关节痛、风寒湿痹、腰酸背痛等症状。古有虎骨追风丸、龙虎散、虎骨酒等方剂，现多用于治疗骨质疏松症。目前由于老虎是重点保护野生动物，因此虎骨禁止作为药材使用。但由于中医药的民间医疗卫生的需要，大量关于虎骨代用品的研究接踵而至，人工虎骨粉即是其中之一。人工虎骨粉已于2003年8月30日被国家食品药品监督管理局批准为一类新药，又名金天格胶囊。其采用非保护动物骨骼与天然虎骨进行对照分析研究，研发出与天然虎骨指纹图谱几乎相同的人工虎骨。与天然虎骨粉成分及安全性相似，具有强筋健骨的作用，用于腰酸背痛，腰膝酸软，下肢痿弱，行走困难等症状的改善。临床上人工虎骨粉用于主要用于骨质疏松症、骨折、类风湿关节炎等骨科疾病的治疗。
[0003]根据公开数据表明，人工虎骨骨粉的总氨基酸含量为16.82克/100克，与天然虎骨粉的16.06克/100克十分一致；采用HPLC分析人工虎骨粉与天然虎骨粉的肽及蛋白质的含量，均分得5个峰，两者在保留时间上基本一致；人工虎骨粉与天然虎骨粉有13种无机元素与微量元素相同。但目前关于人工虎骨中的活性多肽尚未见研究报道，人工虎骨的活性多肽的结构、活性及其提取制备工艺未知。发现人工虎骨中活性多肽及其结构和作用，有助于人工虎骨的二次开发。
专利技术内容
[0004]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种人工虎骨多肽及其制备方法和应用。
[0005]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0006]一种人工虎骨多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
[0007]一种上述的一种人工虎骨多肽的制备方法，包括如下步骤：
[0008](1)取人工虎骨粉1g加入200ml的纯水中，80℃下水浴4h将其溶解，抽滤，取其溶解液。用3KD的超滤膜过滤，收集小于3KDa的多肽溶液，于
‑
40℃真空冷冻干燥，得到多肽冻干粉末；
[0009](2)采用Superdex
TM peptide 10/300GL凝胶过滤分离，将步骤1所得多肽冻干粉末过Superdex
TM peptide 10/300GL凝胶柱进行分离纯化。流动相为含体积比0.1％三氟乙酸和30％乙腈的水溶液，流速为1mL/min,蛋白层析仪检测波长280nm，收集洗脱峰，
‑
40℃真空冷冻干燥。
[0010](3)高效液相色谱纯化，将步骤(2)中得到的多肽过反相高效液相柱，色谱柱为Zorbax SB C
18
(250mm
×
9.4mm,5μm)；柱温为室温；流动相为乙腈和水，梯度洗脱：0～30min，乙腈浓度从0％变至95％，洗脱速度2.5～3.0mL/min,紫外检测波长为220nm，按峰收集组
分，获得人工虎骨多肽。
[0011]一种上述的一种人工虎骨多肽在制备促进成骨细胞增殖和抗骨质疏松方面的药物中应用。
[0012]与已有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提取了人工虎骨多肽，这种多肽在抗骨质疏松、促进成骨形成方面作用显著，为骨质疏松症治疗提供一种可行的研究路径，整体工艺步骤简单，耗材费较少，适合大量推广应用。
附图说明
[0013]图1是人工虎骨3KD以下成分经凝胶柱分离后分离效果图；
[0014]图2是人工虎骨多肽1的反向高效液相色谱分离纯化图；
[0015]图3是人工虎骨多肽2的反向高效液相色谱分离纯化图；
[0016]图4是人工虎骨多肽1和2对成骨细胞增殖的影响，其中(a)为人工虎骨多肽1对成骨细胞增殖的影响，(b)为人工虎骨多肽2对成骨细胞增殖的影响；
[0017]图5是人工虎骨多肽1和2对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响，其中(a)为人工虎骨多肽1对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响，(b)为人工虎骨多肽2对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响。
具体实施方式
[0018]实施例1：
[0019]1材料
[0020]1.1药材
[0021]人工虎骨粉，原料药，金花制药厂，生产批号：210311
‑
1；白色固体粉末。
[0022]1.2实验仪器
[0023]高速冷冻离心机(Thermo Fisher Scientific公司，美国)；Mini PROTEAN Tetra Cell型Tris
‑
甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(BIO
‑
RAD公司，美国)；AR2130型电子精密天平(Ohaus Corp公司，美国)；LC
‑
10N/12N/18N型冷冻干燥机(上海力辰邦西仪器科技有限公司，中国)；DHG
‑
9080A型电热鼓风干燥箱(上海哈伟实业有限公司，中国)；Vivaflow 50 3000MWCO PES超滤仪(Sartorius Stedim Lab Ltd.GL10 3UT,英国)；Sep
‑
Pak Vac 1cc(50mg)tC18柱(Waters公司，美国)；RE
‑
52AA旋转蒸发器(上海青浦沪西仪器厂，中国)；Nano LCU3000系统(Thermo Fisher Scientific公司，美国)；Accaim PepMap 100C18色谱柱(Thermo Fisher公司，美国)；液相色谱
‑
质谱联用仪(Thermo Fisher Scientific公司，美国)
[0024]2方法
[0025]2.1人工虎骨提取条件的单因素实验
[0026]取人工虎骨粉15份各1克，5份为一组。
[0027]第一组测定不同水浴温度对人工虎骨粉溶解百分比的影响。取5份人工虎骨粉分别于200ml超纯水，分别在50℃，60℃，70℃，80℃，90℃不同温度下水浴搅拌提取2h，抽滤，将未溶解的人工虎骨粉末烘干，称重，计算溶解克数/总重量，即为提取率。
[0028]第二组测定不同溶剂体积对人工虎骨粉溶解百分比的影响。取5份人工虎骨粉分
别于80℃，分别在不同体积(100ml，150ml，200ml，250ml，300ml)超纯水中水浴搅拌提取2h，抽滤，将未溶解的人工虎骨粉末烘干，称重，计算溶解克数/总重量，计算提取率。
[0029]第三组测定不同水浴时间对人工虎骨粉溶解百分比的影响。取5份人工虎骨粉分别于80℃，200ml超纯水中，水浴搅拌提取不同时间(1h，2h，3h，4h，5h)，抽滤，将未溶解的人工虎骨粉末烘干，称重，计算溶解克数/总重量，计算提取率。
[0030]2.2抗骨质疏松活性肽的超滤分离
[0031]取本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人工虎骨多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。2.一种权利要求1所述的一种人工虎骨多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取人工虎骨粉1g加入200ml的纯水中，80℃下水浴4h将其溶解，抽滤，取其溶解液。用3KD的超滤膜过滤，收集小于3KDa的多肽溶液，于
‑
40℃真空冷冻干燥，得到多肽冻干粉末；(2)采用Superdex TM peptide 10/300GL凝胶过滤分离，将步骤1所得多肽冻干粉末过Superdex
TM peptide 10/300GL凝胶柱进行分离纯化。流动相为含体积比0.1％三氟乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴曲笛，张泉龙，秦路平，刘玉玲，俞阳，刘燕，吴宣慧，田林坤，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：