一种循环肿瘤细胞捕获方法技术

本发明专利技术涉及一种循环肿瘤细胞捕获方法，包括以下步骤：将待测细胞液进行红细胞裂解后，加入设置有细胞芯片的培养容器中，细胞芯片包括基体以及阵列在基体表面的盲孔，待细胞进入盲孔中后加入培养基进行培养，培养过程中待测细胞液中的循环肿瘤细胞可增殖成细胞球，加入与循环肿瘤细胞特异性反应的荧光抗体，根据荧光和细胞增殖情况定位循环肿瘤细胞。利用规律排列的微孔、荧光抗体、细胞形态以及增殖情况可以精准鉴定和定位CTC，解决了现有技术中由于部分抗体假阳性造成的干扰从而引起的CTC捕获准确度不高以及CTC活力低的问题。获准确度不高以及CTC活力低的问题。获准确度不高以及CTC活力低的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种循环肿瘤细胞捕获方法


[0001]本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及一种循环肿瘤细胞捕获方法。

技术介绍

[0002]目前，癌症相关疾病是全球主要的健康问题之一，每年导致约800万人死亡，预计未来这一数字将迅速增加。因此，癌症治疗和早期诊断技术的研发至关重要。近年来，由于现代生物学技术的不断发展，癌症患者主要的诊断和治疗方法正逐渐从传统标准模式转向精准的个性化模式。循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)的分离和检测是实现肿瘤病人个性化精准医疗的关键研究领域之一。
[0003]CTC是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作导致癌细胞从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落并进入循环系统，可以通过简单的血液检测来发现。大部分CTC在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。大量研究资料证实，血液中CTC的快速检测对肿瘤的检测、个体化治疗、疗效评估及预后监测等具有重要应用价值。相对于传统的影像学和病理学的肿瘤诊断方法，CTC检测具有独特优势。首先，采用CTC检测法能一次性同时筛查肺癌、胃癌、肝癌等大部分多种实体肿瘤，具有更大的检测范围；同时，只需验血，避免了穿刺活检操作导致转移风险；另外，在评估肿瘤治疗效果时，传统影像学手段一般需要几个月的时间，而CTC可以快速评估治疗效果，可以提供有关患者分期(转移性与非转移性)和肿瘤分子特征的实时信息。除了治疗监测和预后预测外，预计CTC将在癌症的早期检测和诊断中发挥重要作用，当癌症无症状或没有可用的常规筛查方法时，CTC的发现对于某些癌症类型的早期诊断非常有帮助，最近已经有一些将CTC筛选用于癌症早期诊断的研究报导。多项研究表明，对CTC进行详细的遗传分析可以更具体地描述癌症患者的进展和预后，并提供新信息，例如对某些化疗或生物疗法的敏感性和耐药性等，以进一步优化治疗方案。目前人外周血CTC检测已被临床公认为最优检测手段之一。
[0004]近年来多个研究团队和公司提出了多种不同的CTC筛选策略。目前CTC捕获技术主要分为两大类，一类基于免疫亲和方法，通过特异性抗体捕获CTC，此类富集方法主要使用磁分离、基于基板和微芯片的捕获平台，其主要缺点和挑战是：(1)由于CTC的异质性，单一的抗体捕获会导致CTC亚群在富集和捕获过程中丢失；(2)在捕获过程中，CTC被绑定到捕获材料的表面，这会导致细胞损伤和活力恢复困难。另一类方法则是基于CTC的物理性质进行捕获，例如大小、密度等，该类方法主要使用密度梯度离心、膜过滤和基于微芯片的捕获平台，主要缺陷在于分离富集的细胞种类无法确认，只能鉴别有或者无，同时癌症患者体内的免疫细胞本身存在一定的异常，而且容易伴随细菌或病毒感染，异常的单核细胞会影响分离富集的准确性。未来CTC可能用于常规临床测试，理想的CTC检测方法应该具有样本处理快捷、操作步骤简单、CTC无损伤、高纯度、高回收率等特点，除此之外，最重要的是捕获到的CTC细胞要有较高的活力，这样才有利于下游增殖和分析。但由于CTC异质性强、数量稀少、从血液中分离困难等现实问题，目前大部分CTC技术捕获到的CTC纯度和活性较差，严重影
响后续的分析准确性和效率。
[0005]由于具有小型化、便携性、成本效益以及在线分离/检测和单细胞分析能力等诸多优势，微流控设备已成为CTC富集和检测的主流平台之一，目前已经基于亲和力、尺寸或其他物理特性开发了许多微芯片平台。中国专利CN202011479571.X公开了一种分离神经母细胞瘤CTC的微流体芯片及其捕获方法，所述微流体芯片内设有微柱阵列用于对样品内的大尺寸细胞进行富集的细胞富集区，以及和该细胞富集区连通的用于对神经母细胞瘤CTC进行特异性捕获的细胞捕获区，该细胞捕获区的基底上修饰有GD2抗体，制备该微流体芯片的聚合物盖片由聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、硅树脂、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚醚醚酮中的至少一种材料制成。捕获神经母细胞瘤CTC时，将外周血以小于18mL/h的流速从入口孔通入芯片，外周血首先经细胞富集区，对大尺寸细胞富集，汇集于中间通道内，而后进入细胞捕获区内通过按临界分选尺寸(7
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10微米)错位排列的微柱阵列和GD2抗体双重捕获作用对神经母细胞瘤CTC进行原位捕获，其他的红细胞和白细胞等则会随着流体冲走。但该专利中仍然存在CTC亚群丢失、CTC活性较差以及分离富集准确度低的问题，以及与现有的微流控芯片一样，存在不利于后续的测序和培养的问题；中国专利CN201780025297.9公开了一种使用贴片进行CTC诊断的方法和装置，所述贴片以具有形成微腔的网状结构的凝胶形式提供并且含有用于检测癌症的试剂(与肿瘤细胞特异性反应的抗体、用于培养细胞的营养试剂、靶向肿瘤细胞细胞核或细胞质或DNA的染色试剂、和/或用于移除肿瘤细胞的细胞膜以提取DNA的试剂)，该贴片固定于板上，获取放置有待测样品的板的图像(如荧光图像)，实现对肿瘤细胞的诊断，但上述方法会由于假阳性的干扰影响定位的准确性。因此，仍需寻找一种新的循环肿瘤细胞捕获方法。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种循环肿瘤细胞捕获方法，利用规律排列的微孔、荧光抗体、细胞形态以及增殖情况可以精准鉴定和定位CTC，解决了现有技术中由于部分抗体假阳性造成的干扰从而引起的CTC捕获准确度不高以及CTC活力低的问题。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种循环肿瘤细胞捕获方法，包括以下步骤：
[0008]将待测细胞液进行红细胞裂解后，加入至设置有细胞芯片的培养容器中，所述细胞芯片包括基体以及阵列在基体表面的盲孔，细胞芯片可为细胞提供一个弱黏附的亲和微环境，既可以防止不同异质性细胞的聚集，又可以为细胞提供3D培养增殖的微环境；
[0009]待细胞进入细胞芯片的盲孔中后加入培养基进行培养，在培养过程中大部分血细胞会凋亡，而循环肿瘤细胞可存活并增殖成细胞球，加入与循环肿瘤细胞特异性反应的荧光抗体，根据荧光和细胞增殖情况定位所述循环肿瘤细胞；具体地，循环肿瘤细胞在特定培养条件下培养后会增殖并形成球状细胞聚集体(球状细胞聚集体指增殖成多个肿瘤细胞或增殖成肿瘤球)，随后成球的循环肿瘤细胞与荧光抗体进行特异性结合，可观察到较明显的显示荧光的球状细胞聚集体，即为所述循环肿瘤细胞；
[0010]培养基为DMEM/F12培养基，还含有5
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15wt％胎牛血清、1
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3wt％青链霉素混合溶液、0.2
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0.8wt％庆大霉素、0.1
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0.3wt％两性霉素B、20
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50ng/mL表皮细胞生长因子、1
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2μM L
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谷氨酰胺、2
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30ng/mL胃泌素、80
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180ng/mL Wnt3a蛋白、200
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400ng/mL R
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spondin1蛋白、50
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于，包括以下步骤：将待测细胞液进行红细胞裂解后，加入设置有细胞芯片的培养容器中，所述细胞芯片包括基体以及阵列在所述基体表面的盲孔；待细胞进入所述盲孔中后加入培养基进行培养，培养过程中待测细胞液中的循环肿瘤细胞增殖成细胞球，加入与所述循环肿瘤细胞特异性反应的荧光抗体，根据荧光和细胞增殖情况定位所述循环肿瘤细胞；所述培养基为DMEM/F12培养基，所述DMEM/F12培养基还含有5
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15wt％胎牛血清、1
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3wt％青链霉素混合溶液、0.2
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0.8wt％庆大霉素、0.1
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0.3wt％两性霉素B、20
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50ng/mL表皮细胞生长因子、1
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2μM L
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谷氨酰胺、2
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30ng/mL胃泌素、80
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180ng/mL Wnt3a蛋白、200
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400ng/mL R
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spondin1蛋白、50
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150ng/mL Noggin蛋白、1
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2μM TGFl 3受体抑制剂和5
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15mM烟酰胺。2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于：所述TGFl 3受体抑制剂为SB43142和/或A83
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01。3.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于：所述青链霉素混合溶液中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：索广力，熊璇，赵喆，刘星志，
申请(专利权)人：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所，
类型：发明
国别省市：