一种川贝母鳞茎组织培养再生方法技术

本发明专利技术涉及一种川贝母鳞茎组织培养再生方法。本发明专利技术所述的川贝母鳞茎组织培养再生方法包括以下环节：S1外植体处理、S2胚性愈伤组织诱导、S3增殖培养、S4分化培养、S5萌发培养、S6植株再生。其中本发明专利技术提供的川贝母鳞茎组织培养再生方法通过在液体环境对川贝母鳞茎愈伤组织进行增殖培养实现短时间内大量增殖，并通过在萌发培养环节对体胚进行短期低温暗培养处理提高体胚的萌发率，从而进一步提高植株的增殖效率。的增殖效率。的增殖效率。

【技术实现步骤摘要】
一种川贝母鳞茎组织培养再生方法


[0001]本专利技术涉及植物组织培养技术，特别是涉及一种快速获得大量再生植株的川贝母鳞茎组织培养再生方法。

技术介绍

[0002]川贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)为百合科,贝母属多年生草本植物。以干燥鳞茎入药，味苦、性寒,有清热润肺，化痰止咳，散结消痈等功效，是治疗肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳嗽，痰中带血，瘰疬的重要中药材。川贝母主要分布在四川、云南、西藏等地，多长于海拔2800～4700米林中、灌丛下、草地、河滩、山谷等湿地或岩缝中，喜冷凉气候条件，具有耐寒、喜湿、喜荫蔽的特性。气温高于30℃或地温高于25℃时，植株就会枯萎；因此，在海拔低、气温高的地区不能存活。川贝母的繁殖方式主要分为种子繁殖和鳞茎繁殖。但由于其特殊的生境，在自然界中川贝母种子繁殖休眠期长、自然萌发率低，出苗率差；而人工栽培时，鳞茎繁殖系数也较低；因此，川贝母历来以采挖野生资源为主，但随着市场对川贝母需求的日益增长，野生川贝母被过度采挖导致资源紧缺，濒临灭绝，目前川贝母野生资源已远远不能满足市场所需，因此如何现实有效解决川贝母资源短缺问题已变得十分迫切。
[0003]利用悬浮培养技术可以在短期内获得大量川贝母再生植株，并且不受季节和环境等因素的限制。而且悬浮培养还具有用材少，繁殖效率高，遗传稳定的特点，因此，从野生川贝母种源中选出优良单株再利用悬浮培养技术来实现川贝母的工厂化生产是解决川贝母资源短缺问题最有效的方法之一。目前虽然已有利用悬浮培养技术获得川贝母再生植株的研究，但是还存在增殖时间长，体胚萌发率低等影响川贝母再生植株增殖率的缺陷。

技术实现思路

[0004]基于此，本专利技术的目的在于，提供一种川贝母鳞茎组织培养再生方法，其具有快速获得大量川贝母再生植株的优点。
[0005]一种川贝母鳞茎组织培养再生方法，包括以下步骤：
[0006]S1外植体处理：选川贝母鳞片作为外植体，消毒，备用；
[0007]S2胚性愈伤组织诱导：将S1处理后的鳞片接种至胚性愈伤诱导培养基中，在25
±
2℃下暗培养至形成胚性愈伤组织；
[0008]S3增殖培养：将S2中获得的胚性愈伤组织按40g/L转接至增殖培养基中，在25℃恒温摇床上120r/min暗培养，每15日继代1次，连续继代4次；
[0009]S4分化培养：对S3中获得的培养物离心去上清后，将留下的细胞团转接至分化培养基中，在25℃恒温摇床上120r/min暗培养，期间至少更换一次培养基，直至分化出直径为1～2mm的体胚；
[0010]S5萌发培养：将S4获得的体胚接种到体胚萌发培养基上进行萌发，先将体胚置于10℃下暗培养7～14日，然后再将其转至培养条件温度为20～25℃，光周期8/16h，光照强度1000～1500Lux的环境下进行培养至体胚发育成基部有白色粗根的乳白色小鳞茎；
[0011]S6植株再生：将S5中得到的已生根的小鳞茎从愈伤组织中分离并转接到SH基础培养基上继续培养至小鳞茎分化抽芽，期间至少更换一次新鲜培养基，培养条件为20～25℃，光周期12/12h，光照强度2000Lux；
[0012]所述胚性愈伤诱导培养基以每升计算，其制备方法为：在SH培养基母液中加入1～2mg的2,4
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D、0.5～1mg的6
‑
BA、0.5～2mg的NAA和30g蔗糖后用水定容至于一升，调节pH至5.8，最后加入2.5g的琼脂；
[0013]所述增殖培养基以每升计算，其制备方法为：在SH培养基母液中加入1～2mg的2,4
‑
D、0.5～1mg的NAA和30g蔗糖后用水定容至一升，调节pH至5.8；
[0014]所述分化培养基以每升计算，其制备方法为：在SH培养基母液加入0.5～2mg的6
‑
BA和45g的蔗糖后用水定容至一升，调节pH至5.8；
[0015]所述萌发培养基以每升计算，其制备方法为：在SH培养基母液加入0.5～2mg的6
‑
BA和30g的蔗糖后用水定容至一升，调节pH至5.8后加入0.5～2g的活性炭和2.5g的琼脂；
[0016]所述SH基础培养基以每升计算，其制备方法为：在SH培养基母液加入30g的蔗糖后用水定容至一升，调节pH至5.8后加入0.5～2g的活性炭和2.5g的琼脂。
[0017]本专利技术中，所述NAA是1
‑
萘乙酸的简称；所述6
‑
BA是6
‑
苄氨基嘌呤的简称，所述2,4
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D是2,4
‑
二氯苯氧乙酸的简称。本专利技术中，所述SH培养基的配方为无水氯化钙(CaCl
2)
151.02mg/L、七水合硫酸镁(MgSO4.7H2O)400mg/L、硝酸钾(KNO3)2500mg/L、磷酸二氢铵(NH4H2PO3)300mg/L。
[0018]本专利技术提供的川贝母鳞茎组织培养再生方法通过在液体环境对川贝母鳞茎愈伤组织进行增殖培养实现短时间内大量增殖，并通过在萌发培养环节对体胚进行短期低温暗培养处理提高了体胚的萌发率，从而进一步提高川贝母的繁育率。
[0019]进一步地，在上述方法的步骤S5中，将体胚置于10℃下暗培养的时间为7日。此时可得到更佳的体胚萌发率。
[0020]进一步地，在上述方法的步骤S3中，所述胚性愈伤组织为从S2中形成的胚性愈伤组织中挑选的浅黄色、疏松呈颗粒状的胚性愈伤组织。
[0021]进一步地，在上述方法的步骤S3中，每个月用20目不锈钢筛网对培养物进行过滤，保留直径小于1mm的细胞继续增殖培养。此时可获得大小均一、分散性良好的细胞系。
[0022]进一步地，在上述方法的在步骤S2中，所述川贝母鳞片切成大小为0.5cm2的块状后再进行接种至胚性愈伤诱导培养基中。
[0023]进一步地，在上述方法的步骤S1中，所述消毒方法为先在流水下对整个鳞茎进行涮洗，去掉表面粗皮和须根；随后将鳞片由内而外分开，再用软刷蘸取洗洁精对其进行涮洗后，最后在自来水下将洗洁精漂净。将洗净的鳞片放入无菌瓶并转入超净工作台内，用75％酒精浸泡15～30s，再用0.1％HgCl2浸泡8～15min，无菌水漂洗5～8次，用无菌滤纸吸干表面水分。
[0024]进一步地，在上述方法的步骤S4中，每7日更换一次培养基；在步骤S6中，每30日更换一次培养基。
[0025]为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本专利技术。
附图说明
[0026]图1是川贝母鳞茎组织培养再生的不同阶段的照片，其中a是川贝母鳞茎；b是从外植体诱导出的胚性愈伤组织；c是增殖培养和分化培养阶段的液体培养环境；d是胚性细胞悬浮系分化出的体细胞胚；d是体细胞胚萌发得到的基部有白色粗根的再生小鳞茎；f是分化出芽的再生小鳞茎。
具体实施方式
[0027]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种川贝母鳞茎组织培养再生方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：S1外植体处理：选川贝母鳞片作为外植体，消毒，备用；S2胚性愈伤组织诱导：将S1处理后的鳞片接种至胚性愈伤诱导培养基中，在25
±
2℃下暗培养至形成胚性愈伤组织；S3增殖培养：将S2中获得的胚性愈伤组织按40g/L转接至增殖培养基中，在25℃恒温摇床上120r/min暗培养，每15日继代1次，连续继代4次；S4分化培养：对S3中获得的培养物离心去上清后，将留下的细胞团转接至分化培养基中，在25℃恒温摇床上120r/min暗培养，期间至少更换一次培养基，直至分化出直径为1～2mm的体胚；S5萌发培养：将S4获得的体胚接种到体胚萌发培养基上进行萌发，先将体胚置于10℃下暗培养7～14日，然后再将其转至培养条件温度为20～25℃，光周期8/16h，光照强度1000～1500Lux的环境下进行培养至体胚发育成基部有白色粗根的乳白色小鳞茎；S6植株再生：将S5中得到的已生根的小鳞茎从愈伤组织中分离并转接到SH基础培养基上继续培养至小鳞茎分化抽芽，期间至少更换一次新鲜培养基，培养条件为20～25℃，光周期12/12h，光照强度2000Lux；所述胚性愈伤诱导培养基以每升计算，其制备方法为：在SH培养基母液中加入1～2mg的2,4
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D、0.5～1mg的6
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BA、0.5～2mg的NAA和30g蔗糖后用水定容至于一升，调节pH至5.8，最后加入2.5g的琼脂；所述增殖培养基以每升计算，其制备方法为：在SH培养基母液中加入1～2mg的2,4
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D、0.5～1mg的NAA和30g蔗糖后用水定容至一升，调节pH至5.8；所述分化培养基以每升计算，其制备方法为：在SH培养基母液加入0.5～2mg的6
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张连娟，林亮，万阳，袁万立，王亚金，张方圆，张权，
申请(专利权)人：云南龙藏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：