一种用于葡萄膨果肥最佳施用时期判断的引物组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于葡萄膨果肥最佳施用时期判断的引物组及其应用，所述引物组包括如下四对引物：(1)检测VvPHO 1基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1~2所示；(2)检测VvPHT 1

【技术实现步骤摘要】
一种用于葡萄膨果肥最佳施用时期判断的引物组及其应用


[0001]本专利技术属于植物生物
，具体涉及用于一种用于葡萄膨果肥最佳施用时期判断的引物组及其应用。

技术介绍

[0002]据《中国农业统计年鉴》统计，截至2019年，我国葡萄种植面积已达726.20hm2，位居柑橘、苹果、梨之后的第四位。葡萄是需要大量肥料的果树，化肥使用不当不仅浪费肥料，还会造成环境污染。精准施肥不仅可以节约肥料，平衡土壤中的养分，还可以减少环境污染，提高葡萄产量。
[0003]叶肥具有操作方便、用量少、肥效快、利用率高、环境污染小等优点。在叶面施肥过程中，可以结合施药，在一定程度上减少劳动力投入。磷和钾是植物生长的重要组成部分，在植物生长发育过程中发挥着非常重要的作用，尤其是在柚子的发育过程中。因此，葡萄喷施磷酸二氢钾可以促进果实膨大，但在生产过程中不能准确掌握喷施时期，造成浪费肥料等问题。因此，葡萄的精准施肥对于产业精细化和高质量发展尤为重要。
[0004]基因表达快于生物性状的变化，利用遗传信息开发的生物标志物广泛应用于动物(裸鲤等)、植物(水稻、菠菜、亚麻等)和人类(遗传疾病)。近年来，相关研究报告指出，基于基因表达信息变化开发的生物标志物可用于指导葡萄生产，例如，王剑等利用葡萄中氮代谢基因的表达评估各种氮肥的效果。张成等利用钾吸收相关基因评价葡萄叶面肥的效果和浓度，Wang等利用葡萄花果相关基因的表达情况来指导施肥。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术的第一个目的是提供一种判断葡萄膨果肥最佳喷施时期的引物组，建立分子方法预测葡萄膨果肥喷施时期；
[0006]本专利技术第二个问题是提供上述引物组在判断葡萄膨果肥最佳喷施时期的应用。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种用于葡萄膨果肥最佳施用时期判断的引物组，包括如下四对引物：
[0009](1)检测基因VvPHO 1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；
[0010](2)检测基因VvPHT 1
‑
4的引物对：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示；
[0011](3)检测基因VvSORK的引物对：其核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示；
[0012](4)检测基因VvKUP2的引物对：其核苷酸序列如SEQ ID NO：7～8所示。
[0013](5)检测基因VvPHT 2
‑
1的引物对：其核苷酸序列如SEQ ID NO：9～10所示。
[0014]本专利技术还保护一种用于葡萄膨果肥最佳施用时期判断的检测试剂盒，包括前文所述的引物组。
[0015]本专利技术还保护一种用于葡萄膨果肥最佳施用时期判断的方法，包括如下步骤：
[0016](1)取葡萄叶片，提取RNA，并反转录为cDNA，以SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4、SEQ ID NO：5～6、SEQ ID NO：7～8、SEQ ID NO：9～10为引物，荧光定量PCR扩增VvPHO 1基
因、VvPHT 1
‑
4基因、VvSORK基因；VvKUP2基因；
[0017](2)若VvSORK和VvKUP2基因的表达趋势由上升转为下降，和/或VvPHO 1和VvPHT 1
‑
4基因的表达趋势由下降转为上升，和/或VvPHO 1/VvPHT 2
‑
1的比值为3～4，和/或VvPHT 1
‑
4/VvPHT 2
‑
1的比值为27～35，叶面喷施磷钾肥。
[0018]作为本申请的优选技术方案，所述步骤(2)中，若VvSORK和VvKUP2基因的表达趋势由上升转为下降，VvPHO 1和VvPHT 1
‑
4基因的表达趋势由下降转为上升，且VvPHO 1/VvPHT 2
‑
1的比值为3～4，VvPHT 1
‑
4/VvPHT 2
‑
1的比值为27～35，叶面喷施KH2PO4。
[0019]作为本申请的优选技术方案，所述磷钾肥为KH2PO4。
[0020]作为本申请的优选技术方案，所述方法可适用于葡萄成年树，不限特定品种。
[0021]优选的，所述的葡萄为
‘
巨峰
’
、
‘
阳光玫瑰
’
品种。
[0022]本专利技术还保护一种用于葡萄膨果肥最佳施用时期判断的引物组在叶面喷施葡萄膨果肥时的应用。
[0023]本专利技术还保护一种用于葡萄膨果肥最佳施用时期判断的引物组的筛选方法，包括如下步骤：
[0024](1)葡萄膨果肥喷施处理：在葡萄坐果后(After Fruit Set，AFS)7d(AFS7)、11d(AFS11)、15d(AFS15)选取发育基本一致的植株，对葡萄叶片正反面均匀喷施0.3％KH2PO4溶液；在AFS3、AFS7、AFS11、AFS15、AFS19喷施之前采集第8～9节位的成熟叶片，并用液氮处理，放﹣80℃冰箱；
[0025](2)样品总RNA提取：提取步骤(1)中所采样品的总RNA，并反转录为cDNA；
[0026](3)标记基因初筛：挑选n(n＞5)个磷钾吸收相关的基因用于生物标记的开发；
[0027](4)标记基因确定及对应的特征表达信号分析：综合n个基因的RT
‑
qPCR结果，选择在膨果肥最佳喷施时期具有相似表达模式的基因为判断膨果肥喷施的marker基因，这一基因在此时的表达模式为膨果肥喷施时期的特征表达信号。
[0028]优选的，总RNA提取：采用改良3％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取葡萄叶片总RNA；总RNA反转录为cDNA(互补脱氧核糖核酸)：以提取的总RNA(DNA酶处理)逆转录产物(cDNA)为荧光定量PCR模板。
[0029]更优选的，荧光定量PCR反应：以反转的cDNA为模版，使用SYBRGreenI(Toyobo)试剂，用内参基因相应的特异引物在AppliedStepOnePlus
TM
Real
‑
Time PCR Systems实时定量PCR仪，获得各个基因的表达数据Ct值。
[0030]优选的，本专利所选择的marker基因信息及对应特征信号如下：
[0031][0032]有益效果：
[0033](1)本专利技术是一种基于PCR技术开发用于葡萄膨果肥最佳施用时期判断的标记基因的方法，与现有技术不同之处在于：本专利技术能从分子水平上预测葡萄营养状况，可提前预测葡萄膨果肥喷施时期，具有高效、精确等特点，且稳定性好，重复性高。
[0034](2)本专利技术首次依据6个标记基因的表达变化趋势和比值变化综合判断葡萄膨果肥喷施时期，其操作相对简单，成本较低，灵敏度高。
附图说明
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于葡萄膨果肥最佳施用时期判断的引物组，其特征在于，包括如下四对引物：(1) 检测基因VvPHO 1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1~2所示；(2) 检测基因VvPHT 1
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4的引物对：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3~4所示；(3) 检测基因VvSORK的引物对：其核苷酸序列如SEQ ID NO：5~6所示；(4) 检测基因VvKUP2的引物对：其核苷酸序列如SEQ ID NO：7~8所示；(5) 检测基因VvPHT 2
‑
1的引物对：其核苷酸序列如SEQ ID NO：9~10所示。2.一种用于葡萄膨果肥最佳施用时期判断的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。3.权利要求1所述的引物组、权利要求2所述的试剂盒在葡萄膨果肥最佳施用时期判断中的应用。4.一种用于葡萄膨果肥最佳施用时期判断的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1) 取葡萄叶片，提取RNA，并反转录为cDNA，以SEQ ID NO：1~2、SEQ ID NO：3~4、SEQ ID NO：5~6、SEQ ID NO：7~8、SEQ ID NO：9~10为引物，荧光定量PCR扩增VvPHO 1基因、VvPHT 1
‑
4基因、VvSORK基因；VvKUP2基因；(2) 若VvSORK和VvKUP2基因的表达趋势由上升转为下降，和/或V...

【专利技术属性】
技术研发人员：上官凌飞，王令宇，房经贵，王晨，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：