本发明专利技术公开了一种用于检测消化道感染性疾病病原体的引物组合，其包括检测EB病毒、巨细胞病毒、奇异变形杆菌、隐孢子虫、伤寒沙门氏菌、卡他莫拉菌、小肠耶尔森氏菌、腺病毒的特异性引物和TaqMan探针；本发明专利技术方法可以同时检测上述3种病毒、4种细菌和1种寄生虫；且灵敏度高，特异性强，操作简单、时间短、成本低廉，对消化道感染患者临床早期诊断具有重要意义。化道感染患者临床早期诊断具有重要意义。化道感染患者临床早期诊断具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
用于检测消化道感染性疾病病原体的引物组合
[0001]本专利技术属于病原体检测
，具体涉及一种同时检测8种消化道感染性疾病病原体的引物和TaqMan探针。
技术介绍
[0002]消化道疾病指的就是人体消化系统方面的疾病，主要是由于食用了被病原体污染了的水或食物，从而引起感染，病原体随排泄物排出病人或携带者体外，经过生活接触污染了手、水、食品和食具吃入体内而感染。该疾病不仅发病率高而且发病范围广泛，可以在所有年龄段的人群中出现，病情还很容易反复的发作，对于患者的身体健康也有很大的影响。消化道感染是一种常见疾病，最常引起感染性腹泻，多因细菌、真菌、病毒、寄生虫等感染导致。常见的消化道传染病有细菌性痢疾、脊髓灰质炎（即小儿麻痹症）、伤寒、副伤寒、霍乱、副霍乱、阿米巴痢疾、各种肠道病毒感染（如柯萨奇病毒、埃可病毒等），细菌性食物中毒以及各种肠道寄生虫病（如蛔虫病、绦虫病、蛲虫病、姜片虫病）等。病原菌种类多，且病原菌与正常菌群共生，致病作用也各不相同。因此及时正确查找病因，制定合理的治疗方案意义重大。
[0003]目前临床检测消化道病原体的方法有很多，如传统的标本直接镜检法，病原体分离培养，免疫学检查法等。目前分离培养法仍作为鉴定病原体的金标准，细菌性感染可通过普通培养基及选择培养基，培养增殖细菌，便于检验鉴定。病毒性病原体可用猴肾、人胚肾、人羊膜细胞及 Hela 等各种传代细胞进行培养，但是该方法耗时长，检出率低，步骤繁琐，条件要求高，需要经验丰富的检测人员，一般实验室难完成。免疫学检查是通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、固相放射免疫法、乳胶凝集试验、化学发光免疫测定等方法，检测粪便中的细菌、病毒、寄生虫的抗原以及血清中的特异性抗体，但该方法存在一定的窗口期，需要一定的检测时间，检出率较低。近年来，随着分子生物学的发展，环介导等温扩增、基因芯片技术、数字PCR技术、NGS测序技术及实时荧光定量PCR技术等核酸检测技术得到发展。这些技术都有灵敏度高、特异性强的优点可对病原体核酸进行检测，但是如LAPM技术、基因芯片、数字PCR技术等均易产生假阳，基因芯片虽然通量高，但是价格昂贵、重复性差。
技术实现思路
[0004]针对现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种用于检测消化道感染性疾病病原体的引物组合，其包括检测EB病毒、巨细胞病毒、奇异变形杆菌、隐孢子虫、伤寒沙门氏菌、卡他莫拉菌、小肠耶尔森氏菌、腺病毒的特异性引物和TaqMan探针，该引物组合用于多重qPCR中，检测中还涉及多重qPCR的常规检测试剂，本专利技术对医生或患者早期及时制定合理的医疗方案具有重要意义。
[0005]所述特异性引物为针对EB病毒的SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2、针对巨细胞病毒的SEQ ID NO:4和 SEQ ID NO:5、针对奇异变形杆菌的SEQ ID NO:7和 SEQ ID NO:8、针对隐孢子虫SEQ ID NO:10和 SEQ ID NO:11、针对伤寒沙门氏菌SEQ ID NO:13和 SEQ ID NO:
14、针对卡他莫拉菌SEQ ID NO:16和 SEQ ID NO:17、针对小肠耶尔森氏菌SEQ ID NO:19和 SEQ ID NO:20、针对腺病毒的SEQ ID NO:22和 SEQ ID NO:23；所述TaqMan探针为针对EB病毒的SEQ ID NO:3、针对巨细胞病毒的SEQ ID NO:6、针对奇异变形杆菌的SEQ ID NO:9、针对隐孢子虫SEQ ID NO:12、针对伤寒沙门氏菌SEQ ID NO:15、卡他莫拉菌SEQ ID NO:18、针对小肠耶尔森氏菌SEQ ID NO:21、针对腺病毒的SEQ ID NO:24。
[0006]TaqMan探针进行标记的荧光基团包括但不限于FAM、ROX、TAMRA、CY5；淬灭荧光基团的标记包括但不限于BHQ1、BHQ2、DABCYL。
[0007]使用上述引物组合的方法如下：1、样品DNA的提取，样本为粪便或肛拭子；2、以步骤1提取的DNA为模板，分别采用qPCR扩增靶基因；扩增体系40μL为：Mix 20μL、上游引物各1μL、下游引物各1μL、TaqMan探针各1μL、模板5μL，剩余用水补齐；PCR扩增体系与步骤1提取的DNA混匀后加入到八连排上进行PCR反应，反应条件为95℃ 30 s预变性，然后依次在95℃ 5 s，58℃ 30 s（读取荧光），进行45个循环；3、PCR结果分析根据步骤2中获得的扩增曲线对EB病毒、巨细胞病毒、奇异变形杆菌、隐孢子虫、伤寒沙门氏菌、卡他莫拉菌、小肠耶尔森氏菌、腺病毒的检测结果进行检测和判读，判断样本中是否含有待检测的病原体感染；检测阳性结果判读包括：（1）内参基因Ct值≤36，阴性对照组、无模板对照组无Ct值；如不符合须再次进行mqPCR检测，或重新提取核酸进行mqPCR检测；（2）病原体Ct值≤36.0，若Ct值＞36.0，需要针对该病原体进行单重qPCR验证；（3）扩增曲线呈标准“S”型且无异常波动。
[0008]与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术通过应用多重荧光定量PCR技术可以快速、准确且灵敏地对多项消化道病原体进行检测，检测灵敏度高、特异性好，具有通量高、时间短、低成本等优点；本专利技术可以定性检测的同时区分出消化道的本专利技术方法可以同时检测上述3种病毒、4种细菌和1种寄生虫，覆盖面广，检测结果可用于临床诊断和治疗。
附图说明
[0009]图1为EB病毒的单重RT
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qPCR特异性试验结果；图2为巨细胞病毒的单重RT
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qPCR特异性试验结果；图3为奇异变形杆菌的单重qPCR特异性试验结果；图4为隐孢子虫的单重qPCR特异性试验结果；图5为伤寒沙门氏菌的单重qPCR特异性试验结果；图6为卡他莫拉菌的单重qPCR特异性试验结果；图7为小肠耶尔森氏菌的单重qPCR特异性试验结果；图8为腺病毒的单重qPCR特异性试验结果；图9为GAPDH的单重qPCR特异性试验结果；
图10为EB病毒、巨细胞病毒、奇异变形杆菌、隐孢子虫和GAPDH的多重RT
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qPCR特异性试验结果；图11为伤寒沙门氏菌、卡他莫拉菌、小肠耶尔森氏菌、腺病毒和GAPDH的多重qPCR特异性试验结果；图12为EB病毒、巨细胞病毒的多重荧光定量PCR的灵敏性试验结果；图13为奇异变形杆菌和隐孢子虫的多重荧光定量PCR的灵敏性试验结果；图14 伤寒沙门氏菌、卡他莫拉菌的多重荧光定量PCR的灵敏性试验结果；图15为小肠耶尔森氏菌和腺病毒的多重荧光定量PCR的灵敏性试验结果；图16为管家基因GAPDH的多重qPCR的灵敏性实验结果。
具体实施方式
[0010]为进一步阐述本专利技术所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本专利技术的技术方案，但本专利技术并非局限在实施例范围内；以下实施例中采用的材料不限于上述列举，可用其他同类材料替代，仪器未注明具体条件的，按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，本领域技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于检测消化道感染性疾病病原体的引物组合，其特征在于：包括检测EB病毒、巨细胞病毒、奇异变形杆菌、隐孢子虫、伤寒沙门氏菌、卡他莫拉菌、小肠耶尔森氏菌、腺病毒的特异性引物和TaqMan探针；所述特异性引物为针对EB病毒的SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2、针对巨细胞病毒的SEQ ID NO:4和 SEQ ID NO:5、针对奇异变形杆菌的SEQ ID NO:7和 SEQ ID NO:8、针对隐孢子虫SEQ ID NO:10和 SEQ ID NO:11、针对伤寒沙门氏菌SEQ ID NO:13和 SEQ ID NO:14、针对卡他莫拉菌SEQ ID NO:16和 SEQ ID NO:17、针对小肠耶尔森氏菌SEQ ID NO:19和 SEQ ID NO:20、针对腺病毒的SEQ ID NO:22和 SEQ ID NO:23；所述TaqMan探针为针对...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏雪山，牛梦伟，冯悦，刘丽，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
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