一种将基因ZmNAC77应用于玉米中增强根系生长的方法技术

本发明专利技术公开一种将基因ZmNAC77应用于玉米中增强根系生长的方法，包括：（1）将ZmNAC77基因表达片段克隆至玉米过表达载体中，获得重组载体。（2）将所述重组载体导入大肠杆菌中，提取质粒后将其转入农杆菌中得重组农杆菌，然后将所述重组农杆菌转化至玉米植株中，收集其成熟的玉米种子。（3）将所述玉米种子播种后筛选出阳性转基因植株，获得独立转化事件的玉米苗后再次进行繁种，并进行阳性纯系转基因株系筛选。（4）测定该阳性纯系转基因株系中的ZmNAC77表达量，选择目标植株。本发明专利技术培育出了能够在玉米中过表达ZmNAC77基因的阳性纯系转基因株系，其根系更长，植株更强壮，也更易生存，有效提高了玉米产量。提高了玉米产量。提高了玉米产量。

A method of applying gene zmnac77 to maize to enhance root growth

【技术实现步骤摘要】
一种将基因ZmNAC77应用于玉米中增强根系生长的方法


[0001]本专利技术涉及玉米增产
，尤其涉及一种将基因ZmNAC77应用于玉米中增强根系生长的方法。

技术介绍

[0002]本专利技术
技术介绍
中公开的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，并不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]玉米是我国主要粮食作物之一，其种植面积远超水稻、小麦等其它粮食作物，稳居我国粮食作物第一位。出了人们公认其作为食物以及饲料的用途外，玉米还有许多工业用途，比如生物乙醇和淀粉的生产，也有研究表明玉米还有作为高价值产品(如重组药物蛋白和特殊化学品)生产载体的价值。然而，玉米作为多糖植物对环境变化较为敏感，使得玉米的产量以及品质易受到环境影响。增强植物生长的多个过程，包括根系的生长发育、叶夹角的增加、细胞的伸长等，都有利于植株抵抗突然的环境胁迫。

技术实现思路

[0004]本专利技术提出一种将基因ZmNAC77应用于玉米中增强根系生长的方法，本专利技术通过新发现的基因ZmNAC77具有促进玉米生长的作用，使该基因在玉米中过表达，有效提高了玉米产量。为实现上述目的，本专利技术技术方案如下所示。
[0005]一种过表达基因ZmNAC77的玉米的制备方法，包括如下步骤：
[0006](1)将ZmNAC77基因表达片段克隆至玉米过表达载体中，获得重组载体。
[0007](2)重组载体转入农杆菌中，获得重组农杆菌，然后将所述重组农杆菌转化至玉米植株中，收集其成熟的玉米种子。
[0008](3)将所述玉米种子播种后筛选出阳性转基因植株，获得独立转化事件的玉米苗后再次进行繁种，并进行阳性纯系转基因株系筛选。
[0009](4)测定所述阳性纯系转基因株系中的ZmNAC77表达量，选择目标植株，即得三种不同表达量的阳性纯合株系。
[0010]进一步地，步骤(1)中，首先依据所述ZmNAC77基因序列设计扩增引物，然后经扩增得到ZmNAC77基因表达片段，最后将所述ZmNAC77基因表达片段克隆至玉米过表达载体中，获得重组载体。
[0011]进一步地，所述扩增引物序列为：
[0012]ZmNAC77
‑
F
‑
1：ACGATGGTGGAGATGTCTGTG；
[0013]ZmNAC77
‑
R
‑
1：CACCGCACCAGGATAGATTTA。
[0014]进一步地，所述玉米过表达载体包括PUBXCN
‑
MYC、pBPC
‑
Zmptill
‑
bar、pCEM
‑
T
‑
35sbar等中的任意一种。
[0015]进一步地，将所述ZmNAC77基因表达片段克隆至PUBXCN
‑
MYC中的方法包括：通过
Sma I内切酶对所述PUBXCN
‑
MYC进行酶切形成含T碱基的粘性末端，得到表达载体。然后利用Taq酶将ZmNAC77 cDNA与该表达载体连接，得到过表达载体ZmNAC77
‑
PUBXCN，即为所述重组载体。
[0016]进一步地，步骤(2)中，将所述质粒转入农杆菌中，获得重组农杆菌，然后利用浸染法将该重组农杆菌转化至以KN5585为背景的玉米植株，收集其成熟的玉米种子，得到ZmANC77过表达转基因株系。
[0017]进一步地，步骤(2)中，所述ZmNAC77过表达转基因株系的获得方法包括：将所述玉米植株的玉米棒子上的玉米须剪去，然后将所述重组农杆菌的菌液从玉米棒子的下部直接注入，待玉米棒子上的玉米籽成熟，收集该成熟的玉米种子，得到ZmNAC77过表达转基因株系。
[0018]优选地，所述菌液的注入的量以玉米须处有菌液渗出为宜。
[0019]进一步地，步骤(3)中，将所述玉米种子晒干后播种，待幼苗长到3～4叶期时用除草剂basta检测筛选阳性转基因植株，获得独立转化事件的玉米苗后再次进行繁种。
[0020]进一步地，步骤(3)中，所述独立转化事件的玉米苗繁种成熟后取玉米棒子上的籽粒，以其叶片总DNA为模板，利用Bar基因进行阳性纯系转基因株系筛选。
[0021]进一步地，步骤(4)中，利用qRT
‑
PCR对所述阳性纯系转基因株系的植株内ZmNAC77表达量进行测定。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有以下方面的有益效果：本专利技术发现，ZmNAC77基因的过表达有助于玉米植株的生长发育，其原因在于ZmNAC77参与调控脂质代谢通路，ZmANC77的过表达可能加快了三酰甘油分解到磷酸酯合成这一条通路的进行，而磷脂酶的增加往往可以诱导如脱落酸、生长素等植物激素含量发生变化。进一步地，本专利技术培育出了能够在玉米中过表达ZmNAC77基因的阳性纯系转基因株系，有效提高了玉米产量。实验显示：同一种植时期的ZmNAC77过表达株系与玉米野生型相比，其根系更长，植株更强壮，也更易生存，对于提高玉米产量的产量具有重要作用。
附图说明
[0023]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。以下，结合附图来详细说明本专利技术的实施方案，其中：
[0024]图1为实施例1中ZmNAC77扩增片段图。
[0025]图2为实施例1中部分过表达株系Bar基因筛选图。
[0026]图3为实施例1中ZmNAC77过表达株系显著性差异分析结果。
[0027]图4为实施例2中部分ZmNAC77基因编辑株系靶标鉴定筛选图。
[0028]图5为下列实施例中野生型、实施例1的ZmNAC77过表达株系、实施例2的基因编辑株系出苗率测定结果图。
[0029]图6为下列实施例中野生型、实施例1的ZmNAC77过表达株系、实施例2的基因编辑株系鲜重测定结果图。
[0030]图7为下列实施例中野生型、实施例1的ZmNAC77过表达株系、实施例2的基因编辑株系三叶期效果图。
[0031]图8为下列实施例中野生型、实施例1的ZmNAC77过表达株系、实施例2的基因编辑株系根系长度测定结果图。
具体实施方式
[0032]在接下来的描述中进一步阐述了本专利技术的具体细节用于充分理解本专利技术。本专利技术中的说明书所使用的术语只是为了用于说明本专利技术的优点和特点，不是旨在于限制本专利技术。
[0033]除非另行定义，本专利技术中所使用的所有专业与科学术语属于本专利技术的
的技术人员所理解的含义相同。如无特殊说明，本专利技术所使用的药品或试剂均按照产品说明书使用或采用所属领域的常规使用方法。现根据说明书附图和具体实施方式对本专利技术的工艺进一步说明。
[0034]实施例1
[0035]一种过表达基因ZmNAC77的玉米的制备方法，包括本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种将基因ZmNAC77应用于玉米中增强根系生长的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将ZmNAC77基因表达片段克隆至玉米过表达载体中，获得重组载体；（2）将所述重组载体导入大肠杆菌中，提取质粒后将其转入农杆菌中，获得重组农杆菌，然后将所述重组农杆菌转化至玉米植株中，收集其成熟的玉米种子；（3）将所述玉米种子播种后筛选出阳性转基因植株，获得独立转化事件的玉米苗后再次进行繁种，并进行阳性纯系转基因株系筛选；（4）测定所述阳性纯系转基因株系中的ZmNAC77表达量，选择目标植株，即得。2.根据权利要求1所述的将基因ZmNAC77应用于玉米中增强根系生长的方法，其特征在于，步骤（1）中，首先依据所述ZmNAC77基因序列设计扩增引物，然后经扩增得到ZmNAC77基因表达片段，最后将所述ZmNAC77基因表达片段克隆至玉米过表达载体中，获得重组载体。3.根据权利要求2所述的将基因ZmNAC77应用于玉米中增强根系生长的方法，其特征在于，所述扩增引物序列为：ZmNAC77
‑
F
‑
1：ACGATGGTGGAGATGTCTGTG；ZmNAC77
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R
‑
1：CACCGCACCAGGATAGATTTA。4.根据权利要求1所述的将基因ZmNAC77应用于玉米中增强根系生长的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述玉米过表达载体包括：PUBXCN
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MYC、pBPC
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Zmptill
‑
bar、pCEM
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T
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35sbar中的任意一种。5.根据权利要求3所述的将基因ZmNAC77应用于玉米中增强根系生长的方法，其特征在于，将所述ZmNAC77基因表达片段克隆至PUBXCN
‑
MYC中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李慧，姜宇航，朱建堂，何文兴，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：