植物乳杆菌O2制造技术

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)O2，保藏号为CGMCC No.24430。本发明专利技术菌株O2对辣椒疫霉菌有显著抑制作用，对辣椒疫霉菌的MIC和MBC分别为12.8mg/mL和25.6mg/mL，并对辣椒红色炭疽菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和阪崎肠杆菌有明显抑制效果。阪崎肠杆菌有明显抑制效果。

Lactobacillus plantarum O2

【技术实现步骤摘要】
nigrum)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，均为现有常规菌株，由湖南农业大学提供。
[0012]培养基：下面实施例用到的培养基未作特殊说明则为常规培养基。MRS肉汤培养基、NA培养基、马铃薯葡萄糖培养基(PDB)、脑心浸液肉汤(BHI)培养基加入18g琼脂粉即配制为相对应的固体培养基。
[0013]实施例1 本菌株O2的分离筛选及鉴定
[0014]初步分离：
[0015]采用稀释涂布平板法采集10g衡阳市盐浸辣椒样品至50ml无菌0.85％(w/v)NaCl，旋涡混匀，依次进行10
‑1‑
10
‑4浓度梯度的稀释。各梯度取100μL涂布在含2％CaCO3(w/v)的MRS固体培养基，37℃培养48h
‑
72h。挑取具有明显溶钙圈的菌落，多次划线纯化直至菌落形态单一、镜检无杂菌，将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性的乳酸菌株，4℃斜面保藏备用。
[0016]筛选：
[0017]挑取备用的保藏菌株单菌落MRS肉汤培养基活化两次，以3％添加量转接至MRS肉汤培养基，37℃静置培养72h得乳酸菌发酵液，4℃备用。取4℃保存的辣椒疫霉菌平皿，用直径10mm打孔器制备疫霉菌菌饼，接种于PDA培养基上，28℃黑暗条件下培养5d后备用。采用平板对峙法，倒入25mL马铃薯琼脂培养基于培养皿中，等待凝固后在培养皿中接入4mm的辣椒疫霉菌菌饼，在间隔菌饼25mm处用打孔器在培养皿中打出两个直径为6mm对称的孔，封底后在各孔中加入100μL乳酸菌发酵液，4℃静置4h后转移至28℃培养72h，同时以加入100μL无菌水作为对照。经筛选得到一株抑菌效果最佳的菌株乳酸菌O2，
‑
80℃甘油冻存管保藏菌株备用。
[0018]鉴定：
[0019]该菌株O2在2％CaCO3(W/V)MRS固体培养基呈乳白色菌落，周边具有典型溶钙圈，菌落呈圆形、边缘整齐、表面光滑且湿润、中央隆起、不透明；在光学显微镜下观察，菌体革兰氏染色呈阳性、短杆状，无芽孢、无荚膜、无鞭毛。
[0020]经生理生化试验，菌株O2碳水化合物反应皆为阳性，触酶试验、葡萄糖产气试验、硝酸盐还原试验、VP试验、H2S试验、明胶液化试验、吲哚试验皆为阴性，在pH 4.5、pH 6.5、4
‑
8％NaCl、37℃环境下生长良好，45℃生长停滞。
[0021]该菌株O2的16S rDNA序列比对鉴定结果表明，该菌株O2与植物乳杆菌同源性为98％，结合形态学特征和生理生化试验结果，鉴定该菌株O2为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)O2，于2022年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.24430。
[0022]实施例2 本专利技术菌株O2发酵上清液抑制辣椒疫霉菌试验
[0023]本专利技术菌株O2发酵上清液制备：取备用菌株O2，经MRS肉汤活化两次后，以3％添加量添加菌株至MRS肉汤，37℃静置培养72h，8000r/min离心10min，上清液经0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
[0024]试验方法：采用固体稀释法，待PDA培养基冷却至55℃左右，以O2发酵上清液为试验组、无菌水为对照，按照1:9(V:V)的比例(试液为1，PDA培养基为9)将试液与培养基混合均匀，每平皿注入约20mL混合液。培养基凝固后，中央加入一块4mm辣椒疫霉菌菌饼，28℃正
置培养7d，采用十字交叉法测量菌落生成直径，计算菌落生长抑制率，重复三次。菌落生长抑制率(％)＝((对照组菌落直径
‑
试验组菌落直径)/对照组菌落直径)
×
100％。
[0025]结合参见图1，加入O2发酵上清液的试验组培养基中辣椒疫霉菌菌落直径为10.13
±
0.52mm，无菌水对照组的辣椒疫霉菌落直径为79.01
±
0.13mm，发酵上清液的对疫霉菌的生长抑制率为87.18％，表明菌株O2发酵上清液对辣椒疫霉菌具有明显的抑菌活性。
[0026]实施例3 本专利技术菌株发酵上清液对辣椒疫霉菌最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定
[0027]本专利技术菌株O2发酵上清液冻干制备：取本专利技术菌株O2，以3％添加量添加至MRS肉汤，37℃静置培养72h，8000r/min离心10min，上清液经0.22μm滤膜过滤除菌后取10mL分装于50mL离心管，
‑
80℃预冷12h，冷冻干燥48h后得到褐色蜂窝状冻干粉0.4946g，冻干转化率为49.46mg/mL，置于
‑
80℃保藏备用。
[0028]称取适量上述菌株O2发酵上清液冻干粉溶解于PDB培养基中，采用二倍稀释法分别配制成256.0、128.0、64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0mg/mL九个浓度梯度，以无菌水为对照，使用0.22μm滤膜过膜除菌，4℃保存备用。按照实施例2的方法进行处理，使发酵上清液终浓度分别为25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0mg/mL，以无疫霉菌生长的最低发酵上清液浓度为最小抑菌浓度。在最小抑菌浓度试验的基础上，继续培养7d，以在14d内无辣椒疫霉菌生长的最低发酵上清液浓度为最小杀菌浓度。
[0029]结果如表1和图2所示，从浓度为0.8mg/mL开始，O2发酵上清液对疫霉菌的生长出现显著抑制作用(p<0.05)，菌落生长抑制率达到7.87％。随着PDA培养基中植物乳杆菌O2发酵上清液含量的上升，疫霉菌的菌落生成直径逐渐减小，其对疫霉菌的生长抑制率逐渐上升。当O2发酵上清液浓度达到12.8mg/mL后，菌落生长抑制率达到100％，7d内未见菌丝生长，故确定12.8mg/mL为菌株O2发酵上清液对辣椒疫霉菌的MIC。由表2可知，28℃培养14d时，浓度为12.8mg/mL的O2发酵上清液对疫霉菌的生长抑制率为91.30％，具有较好的抑菌效果，但要使疫霉菌生长抑制率达到100％，需进一步提高O2发酵上清液浓度至25.6mg/mL，故25.6mg/mL为菌株O2发酵上清液对辣椒疫霉菌的MBC。
[0030]表1 植物乳杆菌O2发酵上清液对辣椒疫霉菌的最小抑菌浓度(MIC)
[0031]冻干粉浓度(mg/mL)菌落生长抑制率(％)0(无菌水对照)0f0.10.51
±
1.21f0.20.44
±
2.16f0.41.30
±
1.78f0.87.87
±
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)O2，保藏号为CGMCC No.24430。2.权利要求1所述的植物乳杆菌O2在抑制辣椒疫霉菌或辣椒红色炭疽菌中的应用。3.权利要求1所述的植物乳杆菌O2在抑制食源性致病菌中的应用，其中，该食源性致病菌为大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌或阪崎肠杆菌。4.利用权利要求1所述的植物乳杆菌O2制备发酵液的方法，其中，该方法是取权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：易有金，孙若兰，黄娇丽，曹熙，周红丽，夏菠，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：