一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法技术

本发明专利技术公开了一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法，通过荧光标记技术、乳糖操纵子技术和聚合酶链式反应技术结合，在植物致病菌基因组中glms基因后插入调节基因（lacI）和红色荧光基因；将含有LacI阻遏蛋白结合位点的lacZ启动子区域与绿色荧光基因的多重抗性可转移质粒转入至植物致病菌，植物致病菌仅红色荧光表达。通过植物致病菌跨种属传播ARGs评估方法，供体菌株体内抗性质粒转移至受体菌株，质粒荧光表达抑制解除，通过荧光显微镜和高通量流式细胞仪可进行分选回收。这种方法能追踪区分供受体菌株，有利于评价土传植物致病菌与ARGs的互作机制，为土传病害阻控策略的制定提供理论依据。策略的制定提供理论依据。策略的制定提供理论依据。

A fluorescent labeling method for tracking the transmission of resistance genes of soil borne plant pathogens

【技术实现步骤摘要】
一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法


[0001]本专利技术属于微生物
，涉及一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法，具体涉及一种土传植物致病菌茄科劳尔氏菌和一种红色与绿色荧光基因表达调控体系。

技术介绍

[0002]由土传植物致病菌引起的植物土传病害严重威胁植物健康和农业可持续经济发展(朱永官,彭静静,韦中,沈其荣,张福锁,2021.土壤微生物组与土壤健康.中国科学:生命科学51,1
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11.)。抗生素的发现在人类和动植物治疗上作出了巨大的贡献，但是随着抗生素的滥用的导致环境中大量抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes，ARGs)富集和传播(Van Boeckel TP,Pires J,Silvester R,et al.2019.Global trends in antimicrobial resistance in animals in low
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and middle
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income countries.Science 356本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法，其特征在于，通过荧光标记技术和乳糖操纵子技术，利用定点插入型转座子Tn7，将融合调节基因（lacI）和第一荧光基因的序列片段插入至植物致病菌基因组中；将含有操纵基因lacZ启动子和第二荧光基因的抗性质粒转入至植物致病菌，得荧光标记的植物致病菌。2.根据权利要求1述的一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法，其特征在于，所述植物致病菌为茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）。3.根据权利要求1或2所述的一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法，其特征在于，所述第一荧光基因为红色荧光基因mCherry。4.根据权利要求1
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3任一所述的一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法，其特征在于，所述第二荧光基因为绿色荧光基因gfp。5.根据权利要求1所述的一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法，其特征在于，包括如下具体步骤：步骤1，植物致病菌基因组荧光标记质粒构建：将调节基因lacI和第一荧光基因进行融合；融合片段回收纯化连接至KS
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质粒载体，再通过酶切、酶连将所需片段连接至Tn7转座子载体质粒，得基因组荧光标记质粒；步骤2，植物致病菌可移动荧光标记质粒构建：将操纵基因lacZ的启动子和第二荧光基因进行扩增和融合，其中操纵基因lacZ的启动子包含lacI基因编码阻遏蛋白结合位点；融合片段回收纯化连接至KS
+
质粒载体上，再通过酶切、酶连将所需片段连接至RP4质粒载体，构建可移动荧光标记质粒；步骤3，植物致病菌双色荧光标记：利用步骤1构建成功的基因组荧光标记质粒，通过含有转座酶pTNS2辅助质粒，将目的片段定点插入在QL
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Rs1115细菌glmS基因下游的attTn7位点，利用含有25
µ
g/mL庆大霉素的BG培养基筛选带有融合基因lacI
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第一荧光的阳性菌株；利用自然转化，将步骤2的质粒转入至前述阳性菌株中，通过含有100
ꢀµ
g/mL卡那霉素、25

【专利技术属性】
技术研发人员：韦中，江高飞，张煜铃，徐阳春，沈其荣，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：