一种植物根系活性氧快速染色定位方法技术

本发明专利技术提供一种植物根系活性氧快速染色定位方法，包括以下步骤：(1)将植物根系固定到容器底部，添加待测活性氧对应的染色液没过样品，放入真空容器中，进行低温真空染色；(2)丢弃染色液，加入固定液，放入真空容器中，进行低温真空固定；(3)丢弃固定液，加入甘油水溶液，放入真空容器中，进行低温真空填充定形；(4)将冷室及切片刀具预冷，将丢弃甘油水溶液的植物根系使用OTC包埋剂进行包埋，调整固定台温度，进行切片；(5)植物根系回温后封片。本发明专利技术方法节约了大量制作时间，实现了快速切片；减少了温度对活性氧代谢的影响，极大提高了切片的准确性；能够保证组织不会收缩，保持原有的生活形态，保证了切片的真实可靠。保证了切片的真实可靠。保证了切片的真实可靠。

A rapid staining and localization method of reactive oxygen species in plant roots

【技术实现步骤摘要】
一种植物根系活性氧快速染色定位方法


[0001]本专利技术涉及一种植物根系活性氧快速染色定位方法。

技术介绍

[0002]植物体内活性氧代谢非常迅速，O2‑
代谢时间以毫秒计算，代谢最慢的H2O2在体内存留的时间也不过数分钟。对植物组织进行活性氧的染色定位时需考虑其不稳定性，且温度越高、处理时间越长越不稳定，结果越不准确。
[0003]植物根系为圆柱形，不可能参考植物叶片的活性氧染色和透明的方法，必需经过切片后才能观察。传统的石蜡切片要经过固定、包埋、切片和染色等步骤，所需时间较长，熔蜡的温度较高，活性氧损失过多，不能用于活性氧定位的研究。
[0004]因此，对活性氧进行定位研究时必需选择快速、准确的方法。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种植物根系活性氧快速染色定位方法。本专利技术使用低温真空染色固定和冰冻切片方法，将活性氧切片完成的时间长度由原来的72h缩短到了12h之内，有效提高了工作效率，且能够极大保存活性氧的原始状态，提高研究准确性。本专利技术的方法可用于直径在3
‑
8mm之间粗细植物根系的活性氧快速染色切片观察。
[0006]本专利技术提供一种植物根系活性氧快速染色定位方法，所述方法包括以下步骤：
[0007](1)将植物根系固定到容器底部，添加待测活性氧对应的染色液没过样品，放入真空容器中，进行低温真空染色；
[0008](2)丢弃染色液，加入固定液，放入真空容器中，进行低温真空固定；
[0009](3)丢弃固定液，加入甘油水溶液，放入真空容器中，进行低温真空填充定形；
[0010](4)将冷室及切片刀具预冷至
‑
18℃到
‑
21℃，将丢弃甘油水溶液的植物根系使用OTC包埋剂进行包埋，调整固定台温度为
‑
18℃至
‑
19℃，进行切片；
[0011](5)植物根系回温后封片。
[0012]作为优选，步骤(1)
‑
步骤(3)中，所述染色液、固定液、甘油水溶液在使用前预冷至0
‑
4℃。
[0013]作为进一步优选，步骤(1)
‑
步骤(3)中，所述染色液、固定液、甘油水溶液在使用前预冷至同一温度。
[0014]作为进一步优选，步骤(1)
‑
步骤(3)中，所述染色液、固定液、甘油水溶液在使用前预冷至0℃。
[0015]作为优选，步骤(1)
‑
步骤(3)中，所述低温真空具体为：将真空容器预冷至0
‑
4℃，使用时抽真空至真空度
‑
0.05MPa以下。
[0016]作为优选，步骤(1)
‑
步骤(3)中，所述低温真空具体为：将真空容器预冷至0℃。
[0017]作为优选，步骤(1)中，所述待测活性氧为O2‑
和H2O2，所述O2‑
的染色液为：用5mmol/
LpH 7.6的3
‑
(n
‑
吗啉)丙烷磺酸钠缓冲液配制的2.5mmol/L的氯化硝基四氮唑蓝溶液；
[0018]所述H2O2的染色液为：向100mmol/LpH 6.9的磷酸钾缓冲液中添加5units/mL辣根过氧化酶，混匀后用其配制成2.5mmol/L 3,3
’‑
二氨基联苯胺溶液。
[0019]作为优选，步骤(2)中，所述固定液为：将5体积份38％甲醛、5体积份冰乙酸、100体积份50％酒精混合配制而成。
[0020]作为优选，步骤(5)中，所述封片为使用中性树胶与二甲苯混合液进行封片，混合液中中性树胶与二甲苯的重量比为1：1。
[0021]本专利技术的有益效果如下：
[0022]1)从材料处理到切片观察的时间短，可在12h之内完成。原有的切片完成时间需要72h以上，节约了大量制作时间，实现了快速切片。
[0023]2)切片结果准确，从取样到切片完成，所有过程都可保持低温，减少了温度对活性氧代谢的影响，极大提高了切片的准确性。
[0024]3)本专利技术方法采用先真空染色，再冷冻切片的方法，保证组织不会收缩，保持原有的生活形态，保证了切片的真实可靠。
[0025]4)活性氧在植物体内一直存在，但是在胁迫处理、物理损伤和/或病原菌接种时，活性氧会集中爆发。本专利技术能够定位和半定量植物根系中的活性氧，大概评估植物根系中活性氧数量。
附图说明
[0026]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0027]图1为枸杞根系接种尖孢镰刀菌8h后O2‑
的组织化学染色。
[0028]图2为枸杞根系接种尖孢镰刀菌72h后H2O2的组织化学染色。
[0029]图3为应用现有技术方法，将枸杞根系针刺并接种尖孢镰刀菌72h后H2O2的组织化学染色。
具体实施方式
[0030]以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。
[0031]一、试剂：
[0032]1、检测O2‑
的染色液为：用5mmol/LpH 7.6的3
‑
(n
‑
吗啉)丙烷磺酸钠缓冲液配制的2.5mmol/L的氯化硝基四氮唑蓝溶液。
[0033]2、检测H2O2的染色液为：向100mmol/LpH 6.9的磷酸钾缓冲液中添加5units/mL辣根过氧化酶，混匀后用其配制成2.5mmol/L3,3
’‑
二氨基联苯胺溶液。
[0034]3、固定液：甲醛
‑
冰乙酸
‑
酒精(FAA)固定液，将浓度38％甲醛5mL、冰乙酸5mL、50％酒精100mL混合配制而成。
[0035]二、本专利技术的一种植物根系活性氧快速染色定位方法步骤如下：
[0036]本专利技术的方法可用于直径在3
‑
8mm之间粗细植物根系的活性氧快速染色切片观
察。
[0037]1、根系样品及处理
[0038]将直径在3
‑
8mm之间粗细的植物根系剪切成适宜长度，迅速固定到离心管底部，以免后期处理时漂浮，影响染色固定效果。
[0039]所述适宜长度可以为0.8
‑
1.2cm。
[0040]所述迅速固定到离心管底部具体是迅速使用重物或夹具将剪切后的植物根系固定到离心管底部。
[0041]2、根系样品染色
[0042]向步骤1所述离心管中添加预冷至0
‑
4℃的检测相应活性氧(活性氧为O2‑
或H2O2)的染色液没过样品，然后将离心管竖直置于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种植物根系活性氧快速染色定位方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：(1)将植物根系固定到容器底部，添加待测活性氧对应的染色液没过样品，放入真空容器中，进行低温真空染色；(2)丢弃染色液，加入固定液，放入真空容器中，进行低温真空固定；(3)丢弃固定液，加入甘油水溶液，放入真空容器中，进行低温真空填充定形；(4)将冷室及切片刀具预冷至
‑
18℃到
‑
21℃，将丢弃甘油水溶液的植物根系使用OTC包埋剂进行包埋，调整固定台温度为
‑
18℃至
‑
19℃，进行切片；(5)植物根系回温后封片。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)
‑
步骤(3)中，所述染色液、固定液、甘油水溶液在使用前预冷至0
‑
4℃。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)
‑
步骤(3)中，所述染色液、固定液、甘油水溶液在使用前预冷至同一温度。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)
‑
步骤(3)中，所述染色液、固定液、甘油水溶液在使用前预冷至0℃。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)

【专利技术属性】
技术研发人员：李捷，冯丽丹，李栋，何静，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：