一种基因工程菌及其在制备二氢大豆苷元中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基因工程菌及其在制备二氢大豆苷元中的应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术通过全细胞催化实验筛选了并鉴定出一组具有大豆苷元还原酶活性的酶，其中氨基酸序列如SEQ ID NO.2~SEQ ID NO.6所示的酶具有大豆苷元还原酶活性，其中有氨基酸序列如SEQ ID NO.2的酶催化活性显著高于来源于Slackia isoflavoniconvertens的大豆苷元还原酶，转化率高达58%。氨基酸序列如SEQIDNO.13~SEQIDNO.16所示的酶的转化率分别为6%、3%、8%、7%。本发明专利技术为大豆苷元还原成二氢大豆苷元提供丰富的可选酶，也为大豆苷元的进一步还原提供更多的可用的酶元件，为促进下游高附加值产品的产量提供了可能性，推动高性能大豆苷元还原酶和二氢大豆苷元的产业化。酶和二氢大豆苷元的产业化。酶和二氢大豆苷元的产业化。

A genetically engineered bacterium and its application in the preparation of dihydrodaidzein

【技术实现步骤摘要】
一种基因工程菌及其在制备二氢大豆苷元中的应用


[0001]本专利技术涉及一种基因工程菌及其在制备二氢大豆苷元中的应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]大豆异黄酮属于黄酮类化合物中的异黄酮类物质，主要来源于大豆，以大豆苷元和染料木素为主，因其与雌激素具有较相似的结构，在功能上也主要表现为雌激素样作用，故而又被称为“植物雌激素”。但是，其功效却不止于雌激素样作用，在增强机体免疫，预防骨质疏松等方面也有重要的作用。大豆异黄酮的生物学功效随着其逐渐被还原而增强，以大豆苷元及其代谢产物为例，生物学功能依次为：雌马酚>四氢大豆苷元>二氢大豆苷元>大豆苷元。作为大豆苷元还原的第一个代谢产物—二氢大豆苷元，其生产量直接限制了后续的进一步还原。
[0003]相较于生物法合成，化学法合成大豆苷元代谢产物涉及复杂的手性拆分问题，后续分离纯化较麻烦，难以实现大批量生产。虽然国内外对酶法制备二氢大豆苷元取得了一定的研究成果，但所获得的大豆苷元还原酶在比活方面比较低，不能满足大规模工业化生产的要求。亟需筛选鉴定出具有高催化活性的且具有大豆苷元还原酶功能的酶，以实现大豆苷元高值转化的替代方案。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术通过全细胞催化实验筛选了并鉴定出一组具有大豆苷元还原酶活性的酶，其中，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的酶的催化活性高于来源于Slackia isoflavoniconvertens的大豆苷元还原酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.3~6所示的酶同样具有催化大豆苷元为二氢大豆苷元的功能，为大豆苷元转化为二氢大豆苷元提供可使用的酶元件，并进一步推动二氢大豆苷元的产业化。
[0005]本专利技术提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2~SEQ ID NO.6任一所示的酶。
[0006]在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌是以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、毕赤酵母（Pichia pastoris）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、大肠杆菌（Escherichia coli）为宿主，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET系列质粒为表达载体。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET28(a)质粒为表达载体。
[0009]本专利技术还提供了一种全细胞催化剂，所述全细胞催化剂含有上述基因工程菌。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述全细胞催化剂中还含有冻干保护剂。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述冻干保护剂包括脱脂奶粉、蔗糖、谷氨酸钠、微晶纤维素和/或海藻糖。
[0012]本专利技术提供了一种核酸分子，其编码具有将大豆苷元转化为二氢大豆苷元功能的蛋白，核苷酸序列如SEQ ID NO.12~SEQ ID NO.16所示。
[0013]本专利技术还提供了携带上述核酸分子的表达载体。
[0014]本专利技术还提供了含有上述核酸分子或上述表达载体的微生物细胞。
[0015]在一种实施方式中，所述微生物细胞包括细菌细胞和真菌细胞。
[0016]本专利技术还提供了一种制备具备大豆苷元还原酶活性的蛋白的方法，所述方法为将上述基因工程菌接种于培养基中进行诱导培养。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为将上述基因工程菌接种至培养基中，于35~40℃培养至OD600为0.02~0.04，加入终浓度为0.01~1 mM的IPTG，于22~25℃、125~175 rpm条件下诱导表达5~15 h。
[0018]本专利技术还提供了一种制备二氢大豆苷元的方法，所述方法为将氨基酸序列如SEQ ID NO.2~SEQ ID NO.6任一所示的酶，或上述全细胞催化剂添加至含有大豆苷元的反应体系中。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法的反应条件为22~25℃、120~175 rpm。
[0020]本专利技术还提供了一种二氢大豆苷元的生产方法，所述方法由上述基因工程菌合成获得二氢大豆苷元。
[0021]本专利技术提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.2~SEQ ID NO.6任一所示的酶，或上述基因工程菌，或上述全细胞催化剂，或上述方法在制备含有二氢大豆苷元及其下游产物的产品中的应用。
[0022]本专利技术提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.2~SEQ ID NO.6任一所示的酶在制备含有二氢大豆苷元及其下游产物的产品中的应用。
[0023]本专利技术提供了上述基因，或上述表达载体，或上述微生物细胞在制备含有二氢大豆苷元及其下游产物的产品中的应用。
[0024]有益效果：1、本专利技术通过全细胞催化实验筛选了并鉴定出一组具有催化大豆苷元还原成二氢大豆苷元活性的酶，其中氨基酸序列如SEQ ID NO.2~SEQ ID NO.6所示的酶具有大豆苷元还原酶活性，可以将大豆苷元转化为二氢大豆苷元。氨基酸序列如SEQ ID NO.2的酶的催化活性显著高于来源于Slackia isoflavoniconvertens的大豆苷元还原酶，转化率达到58%。
[0025]2、本专利技术为大豆苷元还原成二氢大豆苷元提供丰富的可选酶，也为大豆苷元的进一步还原提供更多的可用的酶元件，为促进下游高附加值产品的产量提供了可能性，推动二氢大豆苷元的产业化。
附图说明
[0026]图1为表达载体构建图；图2为全细胞催化的色谱图；图3为转化产物二氢大豆苷元的质谱图；图4为全细胞催化验证催化能力的产量比较图。
具体实施方式
[0027]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。
[0028]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。
[0029]（一）培养基及试剂LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L。配制固体培养基还需加入18 g/L琼脂粉。
[0030]TB培养基：蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，甘油4 mL、KH2PO
4 2.31 g/L、K2HPO
4 12.54 g/L。
[0031]200 mM大豆苷元DMSO储备液：200 mmol大豆苷元溶解于500 mL DMSO中再定容到1L。
[0032]（二）大肠杆菌感受态细胞的制备将大肠杆菌E.coli BL21(DE3)划线于LB平板中培养12 h后，挑取单菌落接种于5 mL液体LB培养基中培养8
‑
10 h，以2 %（本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达核苷酸序列如SEQ ID NO.12~SEQ ID NO.16任一所示的酶。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主。3.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的基因工程菌。4.一种核酸分子，编码具有将大豆苷元转化为二氢大豆苷元功能的蛋白，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.12~SEQ ID NO.16所示。5.携带权利要求4所述核酸分子的表达载体。6.含有权利要求4所述核酸分子或权利要求5所述表达载体的微生物细胞。7.一种制备二氢大豆苷元的方法，其特征在于，所述方法为将氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，邓汉宁，张天萌，张伟平，刘云鹏，徐沙，曾伟主，余世琴，
申请(专利权)人：江南大学江苏华熙益能生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：