检测人体液中人疱疹病毒6B型的PCR引物组及其微滴式数字PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测人体液中人疱疹病毒6B型的PCR引物组及其微滴式数字PCR试剂盒。本发明专利技术基于人疱疹病毒6B基因组的保守序列设计特异性引物及MGB水解探针，从而得到微滴式数字PCR试剂盒，本发明专利技术通过提取接受了嵌合抗原受体T细胞治疗后的血液系统疾病患者体液中的游离DNA，通过微滴式数字PCR试剂盒检测HHV

PCR primer set for detecting human herpesvirus 6b in human fluid and its micro drop digital PCR kit

【技术实现步骤摘要】
检测人体液中人疱疹病毒6B型的PCR引物组及其微滴式数字PCR试剂盒


[0001]本专利技术涉及病毒核酸检测领域，具体涉及一种检测人体液中人疱疹病毒6B型的PCR引物组及其微滴式数字PCR试剂盒。

技术介绍

[0002]人类疱疹病毒6型(human herpesvirus 6，HHV
‑
6)属疱疹病毒科β亚科，嗜T淋巴细胞的双链DNA病毒，HHV
‑
6原发感染后可在机体内终身潜伏，90％的成年人存在HHV
‑
6的潜伏感染并且在免疫力低下人群如造血干细胞移植、器官移植、艾滋病等患者体内发生再激活，在造血干细胞移植人群中发生再激活比例达到30
‑
50％。HHV
‑
6可分为HHV
‑
6A和HHV
‑
6B两个亚型，HHV
‑
6B是在人体各种体液中被检测到最多的亚型，可引起多种疾病，相比之下HHV
‑
6A的感染率较低，原发感染一般无症状，研究较少。HHV
‑
6的感染可整合至人染色体端粒区域，称为染色体整合HHV
‑
6(ciHHV
‑
6)，ciHHV
‑
6可发生在体细胞，也可发生在生殖细胞，携带ciHHV
‑
6的机体通常单个细胞只含有一个HHV
‑
6基因组，外周血细胞或血浆中会有较高载量的病毒检出，这种情况无需治疗，需要从活动性HHV
‑
6感染中鉴别出来。
[0003]CAR
‑
T细胞免疫疗法是继造血干细胞移植后一种极具前景的新疗法，已提升为多种复发难治的血液系统恶性疾病的二线甚至一线治疗方式，对部分患者甚是达到了治愈的目的。CAR
‑
T治疗也可能发生多种并发症，包括感染、细胞因子释放综合征(CRS)、白细胞减少、肿瘤溶解综合征等，CAR
‑
T治疗后患者由于免疫力低下可引起HHV
‑
6B再激活，最严重的是诱发脑炎，可出现言语不清、谵妄、癫痫等神经系统症状，CAR
‑
T细胞治疗后3
‑
4级CRS也可引起类似的不典型的神经系统症状，称为CRES；二者难以鉴别。
[0004]对10名CAR
‑
T治疗后患者的HHV
‑
6B连续cfDNA定量监测分析发现，HHV
‑
6B感染起始的高发时间在CAR
‑
T回输后8～19天，而CRS开始发生的时间范围为1～7天，这说明化疗预处理以及B细胞发育不良等原因会增加HHV
‑
6B激活的感染风险，二者发生的时间相近。CAR
‑
T细胞治疗后常用抗白细胞介素6或白细胞介素6受体单克隆抗体和大剂量皮质类固醇激素常用于治疗CRS，使得接受CAR
‑
T治疗后的患者增加了HHV
‑
6B感染及病毒性脑炎发生的危险，这更加增加了鉴别诊断的困难性和必要性。临床上HHV
‑
6B感染与CRES的治疗方案不同，CRES以激素以及IL
‑
6受体抑制剂治疗为主，HHV
‑
6B感染则以抗病毒治疗为主。
[0005]因此，HHV
‑
6B的活动性感染及与CRES相鉴别，有利于CAR
‑
T患者的治疗与临床管理，关系到CAR
‑
T治疗的临床结局；目前，迫切需要一种检测人疱疹病毒6B型的PCR引物组试剂盒。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供了一种检测CAR
‑
T治疗后患者的体液中人疱疹病毒6B型HHV
‑
6B的PCR引物组及其微滴式数字PCR试剂盒；本专利技术基于NCBI上人疱疹病毒6型病毒株NY
‑
380的基因组序列及本中心HHV
‑
6B感染患者宏基因组测序的结果序列设计HHV
‑
6B特异
性引物及MGB水解探针，从而得到微滴式数字PCR试剂盒，本专利技术通过CAR
‑
T治疗后患者体液标本上清游离DNA和微滴式数字PCR试剂盒检测HHV
‑
6B的拷贝数，对辅助临床诊断患者是否患有HHV
‑
6B感染具有重要指导意义。
[0007]为实现上述目的，本专利技术所设计一种检测人体液中人疱疹病毒6B型的PCR引物组，所述PCR引物组由引物对HHV
‑
6B
‑
FR和探针引物HHV
‑
6B
‑
P1组成，其中，所述引物对HHV
‑
6B
‑
FR为：
[0008]上游引物HHV
‑
6B
‑
F1：
[0009]5’‑
TCCATTGTTTGATTGATTTCCGTAT
‑3’
，
[0010]下游引物HHV
‑
6B
‑
R1：5
’‑
AACGCGGGATGTTCTATTGG
‑3’
；
[0011]所述探针HHV
‑
6B
‑
P1：5
’‑
CTTGAGCTTGTAGATAAT
‑3’
，且探针HHV
‑
6B
‑
P1的5
’
端标记有荧光基团，其3
’
端标记有非荧光淬灭基团。
[0012]进一步地，所述荧光基团为FAM，所述非荧光淬灭基团为MGB。
[0013]本专利技术还提供了一种检测体液标本中HHV
‑
6B的微滴式数字PCR试剂盒，所述PCR试剂盒包括权利要求1所述PCR引物组。
[0014]进一步地，所述微滴式数字PCR试剂盒还包括数字PCR缓冲液、微滴生成油、微滴生成卡、96孔板和铝箔热封膜。
[0015]再进一步地，所述PCR试剂盒还包括内控基因引物组(根据针对编码人核糖核蛋白复合体亚基基因RPP29设计得到)，所述内控基因引物组由内控引物对RPP29
‑
FR和内控探针引物RPP29
‑
P，其中，
[0016]所述内控引物对RPP29
‑
FR为包括
[0017]上游引物RPP29
‑
F：5
’‑
GGCGGTGGTCCTGGAGTACT
‑3’
，下游引物RPP29
‑
R：5
’‑
AGAGGCCTTTGGCTTTCTTCTT
‑3’
；
[0018]所述内控探针引物RPP29
‑
P：5
’‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测人体液中人疱疹病毒6B型的PCR引物组，其特征在于：所述PCR引物组由引物对HHV
‑
6B
‑
FR和探针引物HHV
‑
6B
‑
P1组成，其中，所述引物对HHV
‑
6B
‑
FR为：上游引物HHV
‑
6B
‑
F1：5
’‑
TCCATTGTTTGATTGATTTCCGTAT
‑3’
，下游引物HHV
‑
6B
‑
R1：5
’‑
AACGCGGGATGTTCTATTGG
‑3’
；所述探针HHV
‑
6B
‑
P1：5
’‑
CTTGAGCTTGTAGATAAT
‑3’
，且探针HHV
‑
6B
‑
P1的5
’
端标记有荧光基团，其3
’
端标记有非荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的PCR引物组，其特征在于：所述探针荧光基团为FAM，所述非荧光淬灭基团为MGB。3.一种检测人体液中中HHV
‑
6B的微滴式数字PCR试剂盒，其特征在于：所述PCR试剂盒包括权利要求1所述PCR引物组。4.根据权利要求3所述的微滴式数字PCR试剂盒，其特征在于：所述微滴式数字PCR试剂盒还包括数字PCR缓冲液、微滴生成油、微滴生成卡、96孔板和铝箔热封膜。5.根据权利要求3和4所述的微滴式数字PCR试剂盒，其特征在于：所述PCR试剂盒还包括内控基因引物组，所述内控基因引物组由内控引物对RPP29
‑
FR和内控探针引物RPP29
‑
P，其中，所述内控引物对RPP29
‑
FR为：上游引物RPP29
‑
F：5
’‑
GGCGGTGGTCCTGGAGTACT
‑3’
，下游...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈丽婷，顾佳，纪红艳，周剑峰，肖敏，黄亮，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：